張靜榮，王 斌，姜 紅，王 毅，李 雪，司 敏，李永才，畢 陽*

梨是溫帶地區(qū)的重要水果，但梨果實在采收及采后各環(huán)節(jié)中易遭受機械損傷，果實表面形成的傷口為病原物的侵染提供了通道，導(dǎo)致采后病害發(fā)生[1]。多種真菌與梨果實的采后病害相關(guān)，其中由互隔交鏈孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病是我國北方梨果實的最常見病害[2]。有報道表明，果蔬具備采后愈傷的能力，通過自我激活一系列的防御代謝來促進(jìn)傷口愈合，從而有效抑制水分蒸騰，阻止病原菌的侵入[3]。但正常的自然愈傷所需時間偏長，因此有效縮短梨果實愈傷時間是當(dāng)前生產(chǎn)中亟待解決的問題。Spotts等[4]發(fā)現(xiàn)，‘d’Anjou’和‘Bosc’兩品種西洋梨果實在20 ℃下愈傷2 d后，再在傷口處接種灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum），灰霉病和青霉病的發(fā)病率明顯降低；對傷口處組織觀察發(fā)現(xiàn)，有纖維素、軟木脂及單寧等愈傷成分的積累。同樣，蘋果果實分別在20 ℃和38 ℃下愈傷4 d后，再在傷口處接種B. cinerea和P. expansum后，發(fā)現(xiàn)熱處理下灰霉病和青霉病的發(fā)病率顯著降低，傷口處組織有明顯的酚類及木質(zhì)素等愈傷成分沉積[5]。苯丙噻重氮（benzothiadiazole，BTH）是一種人工合成的水楊酸類似物，可誘導(dǎo)多種果蔬的采后抗病性[6]。BTH采后處理可以誘導(dǎo)鴨梨果實對P. expansum的抗性[7]，還可增強蘋果果實的采后抗病性[8]。BTH誘導(dǎo)果實抗性的機理主要與激活苯丙烷代謝、促進(jìn)活性氧代謝，以及表達(dá)病程蛋白基因有關(guān)[9]。雖然已有仁果類果實愈傷以及BTH誘導(dǎo)仁果類果實采后抗病性的報道。但鮮見BTH處理對仁果類果實采后愈傷能力影響的報道。本實驗以‘玉露香’梨為原料，人工模擬損傷后用100 g/L BTH處理傷口，在常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%條件下進(jìn)行愈傷，通過觀察果實質(zhì)量損失率和損傷接種A. alternata后的發(fā)病率以及測定愈傷期間傷口處組織苯丙烷代謝關(guān)鍵酶和產(chǎn)物的積累，以及抗氧化酶的活力變化，通過比較處理組和對照組之間的差異來評價愈傷效果，為BTH誘導(dǎo)梨果實的快速愈傷提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘玉露香’梨于2015年10月采自甘肅省景泰縣國營條山集團(tuán)梨生產(chǎn)基地，選取外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，單果套網(wǎng)套后入瓦楞紙包裝箱，于當(dāng)天運抵甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物學(xué)與技術(shù)實驗室，于常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%條件下貯藏待用。供試A. alternata由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實驗室提供，PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保存待用。

BTH（有效體積分?jǐn)?shù)50%） 北京Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯工業(yè)有限公司；UV2450型島津分析儀器 日本島津公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；1510-04087型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梨果實人工損傷、BTH處理及愈傷

參考Fu Da等[10]的方法并作修改。梨果實先用清水沖洗，然后用體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗、晾干后，用滅菌接種釘在梨果實的赤道部位均勻刺出3 個深3 mm、直徑3 mm的傷口。0.5 h后將損傷的梨果實浸入100 g/L BTH中5 min，取出晾干后分別裝入打孔的聚乙烯保鮮袋（25 cm×40 cm，厚0.02 mm），于常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%的黑暗條件下進(jìn)行愈傷。以清水處理作對照。每處理用梨果實100 個，重復(fù)3 次。1.3.2 愈傷效果的評價

1.3.2.1 質(zhì)量損失率的測定

參照曹建康等[11]的方法。采用質(zhì)量法測定愈傷期間梨果實的質(zhì)量損失率。每個處理用梨果實15 個，重復(fù)3 次。

1.3.2.2 發(fā)病率的測定

參照Li Yongcai等[12]的方法。于培養(yǎng)7 d的A. alternata培養(yǎng)皿中加入適量的無菌水，用涂布器刮下培養(yǎng)基表面的孢子，用4 層紗布過濾至三角瓶中，振蕩20 s，采用血球計數(shù)板計數(shù)，制備成濃度為1×106CFU/mL的孢子懸浮液。在梨果實愈傷的第0、0.5、1、2、4、6天，將已配制好的20 μL孢子懸浮液注入梨果實人工損傷的傷口處，接種梨果實重新裝入打孔聚乙烯保鮮袋中，于常溫黑暗條件下愈傷，4 d后統(tǒng)計損傷接種梨果實的發(fā)病率，表皮出現(xiàn)黑斑且病斑直徑超過3 mm計作病果。每個處理用梨果實15 個，重復(fù)3 次。

1.3.3 生化測定樣品取樣

在愈傷后的第0、0.5、1、2、4、6天時，采用手術(shù)刀切取創(chuàng)口周邊5 mm、深3 mm的愈傷組織3 g，錫箔紙包好后液氮冷凍，在-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3.4 PAL、SOD、POD、PPO活力及蛋白質(zhì)含量的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的測定參照葛永紅等[13]方法。取冷凍組織3 g，用3 mL 0.05 mol/L的硼酸緩沖液（含1 g/100 mL聚乙烯聚吡咯烷酮（poly-vinylpolypyrrolidone，PVPP）、5 mmol/L?β-琉基乙醇，pH 8.8）冰浴研磨成勻漿，4 ℃、15 000×g離心30 min，取上清液用于酶活力的測定。反應(yīng)體系：在500 μL粗酶液中加入0.05 mol/L的硼酸緩沖液中（pH 8.8），再加入20 mmol/L的L-苯丙氨酸，37 ℃保溫30 min，充分混合后于290 nm波長處測定吸光度，作為反應(yīng)初始值（A0）。再在37 ℃下反應(yīng)60 min，測定其吸光度（A1）。對照組以硼酸緩沖液代替酶液。以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為1 個活力單位（U），酶活力單位為U/mg。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定參照Venisse等[14]方法。取3.0 g冷凍組織，加入3 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5，含5 mmol/L二硫蘇糖醇和2 g/100 mL PVPP），冰浴條件下研磨成勻漿后于4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液立即用于酶活力測定。取5 mL指形管4 支，2 支為測定管，另2 支為對照管，依次加入1.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mmol/L甲硫氨酸溶液、0.3 mL 750 μmol/L氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）溶液、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-2Na溶液、0.3 mL粗酶液，最后加入0.3 mL 20 μmol/L核黃素。其中對照組的2 支管以緩沖液代替酶液，混勻后將1 支對照管置于暗處，其他各管于4 000 Lux日光燈下反應(yīng)15 min。至反應(yīng)結(jié)束后，以暗處對照作空白參比，于560 nm波長處分別測定其他各管的吸光度。以每毫克蛋白抑制NBT光化還原的50%為一個酶活力單位（U/mg）。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照Bradford[15]方法。取冷凍組織3 g，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 5.9，含0.5 g/100 mL PVPP），冰浴下充分研磨成勻漿，在4 ℃ 11 250 r/min下離心20 min，上清液立即用于POD活力測定。反應(yīng)體系包括：2.5 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚、200 μL 250 mmol/L H2O2和200 μL上清液，加入上清液15 s后用酶標(biāo)儀開始記錄反映體系在470 nm波長處的吸光度變化，連續(xù)測定2 min，以每分鐘吸光度變化0.01為一個POD活力單位（U），酶活力單位為U/mg。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參照Li Yongcai等[12]的方法。取冷凍組織3 g，加入3 mL pH 7.5的50 mmol/L的磷酸提取緩沖液（內(nèi)含4 g/100mL PVPP、1 mmon/L聚乙二醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、體積分?jǐn)?shù)0.01 % Triton X-100），冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、15 000×g離心20 min，取上清液為粗酶液。反應(yīng)體系包括：2 mL pH 7.5的磷酸緩沖液、100 μL粗酶提取液。空白組不加酶液，其余同反應(yīng)體系。以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.01為1 個活力單位（U），酶活力單位為U/mg。

1.3.5 木質(zhì)素、總酚及類黃酮含量的測定

木質(zhì)素含量的測定參照Yin Yan等[16]方法。取冷凍組織3 g，在預(yù)冷的5 mL 、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液中研磨成勻漿狀，然后4 ℃、14 000×g離心30 min，棄去上清液，將沉淀物用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液沖洗3 次，再用乙醇-正己烷（1∶2，V/V）溶液沖洗3 次，再次收集沉淀在60 ℃烘箱中干燥24 h，將干燥物轉(zhuǎn)移至離心管中，溶于1 mL溴化乙酰-冰醋酸（1∶4，V/V）溶液，70 ℃恒溫水浴30 min，最后加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸溶液，離心，取上清液0.5 mL，用冰醋酸定容至5 mL，在280 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3 次。木質(zhì)素含量以A280nm表征，以鮮質(zhì)量計。

總酚及類黃酮含量的測定參照Yin Yan等[16]方法。取冷凍組織3 g，于預(yù)冷的 5 mL體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸-甲醇溶液中，冰浴研磨成勻漿，然后于4 ℃下12 000×g離心30 min，收集上清液分別于280、325 nm波長處測定吸光度。總酚與類黃酮含量分別以A280nm和A325nm表征，以鮮質(zhì)量計。

上述各項測定均做3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

全部數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTH處理對梨果實愈傷期間質(zhì)量損失率和發(fā)病率的影響

圖1 BTH處理對愈傷期間梨果實質(zhì)量損失率（A）和發(fā)病率（B）的影響Fig. 1 Effect of BTH treatment on weight loss rate (A) and decay incidence (B) of pear fruits during wound healing

由圖1可知，愈傷期間，對照組和BHT處理組果實的質(zhì)量損失率均逐漸升高，雖然BHT處理組果實的質(zhì)量損失率始終低于對照組，但無顯著差異。對照組和BHT處理組果實的發(fā)病率隨愈傷時間的延長而逐漸降低，但BTH處理組果實的發(fā)病率明顯低于對照組，第4天時，BTH處理組果實的發(fā)病率僅為對照組的40%，第6天時，處理組果實的發(fā)病率已降至13%，而對照組果實的發(fā)病率仍高達(dá)34%（圖1B）。

2.2 BTH處理對愈傷期間梨果實PAL、SOD、POD、PPO活力的影響

圖2 BTH處理對梨果實愈傷期間PAL（A）、SOD（B）、POD（C）及PPO（D）活力的影響Fig. 2 Effect of BTH treatment on PAL (A), SOD (B), POD(C) and PPO (D) activities in pear fruits during wound healing

由圖2A可知，愈傷期間，對照組梨果實的PAL活力除在第4天稍有升高外，其他時間基本保持平穩(wěn)。而BTH處理組梨果實的PAL活力在0.5 d內(nèi)快速升高，之后保持平穩(wěn)，4 d之后又開始上升。BTH處理組梨果實的PAL活力在愈傷期間始終明顯高于對照組，且在第0.5天和第6天時，分別高于同期對照組1.29 倍和2.16 倍。對照組梨果實的SOD的活力則整體呈降低趨勢，處理組梨果實的SOD活力在愈傷期間先升高后降低(圖2B)，處理組梨果實的SOD活力始終高于對照組，在第0.5天和第6天時，分別高出同期對照組50%和2.8 倍。處理組梨果實的POD活力在愈傷期間逐漸升高，對照組果實則是先降低后升高(圖2C)，愈傷1 d后處理組果實的POD活力始終高于對照組，第1天和6天時，分別高出同期對照組2.5 倍和1.3 倍。處理組梨果實中的PPO活力在愈傷期間總體呈升高的趨勢，對照組梨果實則出現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢（圖3D），處理組梨果實的PPO活力始終高于對照組，在第1天和第6天時，分別高出同期對照組6.4 倍和3.1 倍。

2.3 BTH處理對梨果實愈傷期間的總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的影響

總酚含量先上升后維持穩(wěn)定，處理組梨果實的總酚含量在0.5 d后整體高于對照組，第1天和第6天時，分別比同期對照組高19.0%和19.8%（圖3A）。愈傷前期處理組和對照組梨果實中的類黃酮含量均迅速升高，0.5 d后對照組梨果實的類黃酮含量開始下降并保持平穩(wěn)，處理組梨果實則持續(xù)上升，且至第4天達(dá)到峰值，第1天和第4天時，處理組梨果實的類黃酮含量分別高于同期對照組63%和94%(圖3B)。對照組梨果實的木質(zhì)素含量在愈傷后期則基本保持穩(wěn)定，處理組梨果實的木質(zhì)素含量在愈傷前期迅速升高后保持平穩(wěn)，至第4天達(dá)到峰值，處理組梨果實的含量始終高于對照組(圖3C)，在第0.5天和第4天時，分別高出同期對照組1.4 倍和75%。

圖3 BTH處理對梨果實愈傷期間總酚（A）、類黃酮（B）和木質(zhì)素（C）含量的影響Fig. 3 Effect of BTH treatment on the contents of total phenols (A),flavonoids (B) and lignin (C) in pear fruits during wound healing

2.4 BTH處理后梨果實發(fā)病率和相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

表1 BTH處理后梨果實發(fā)病率和相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation between BTH treatment and related parameters of pear fruits

由表1可見，處理梨果實的發(fā)病率和PAL活力、總酚含量、類黃酮含量之間均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.538、0.496、0.502。由此表明，BTH處理通過提高PAL活力激活了苯丙烷代謝，從而促進(jìn)了梨果實愈傷，且抑菌物質(zhì)總酚、類黃酮在抑制梨果實發(fā)病率方面起到了重要的作用。處理組梨果實的發(fā)病率與POD和PPO活力之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.594、0.638。由此表明，POD及PPO在促進(jìn)愈傷物質(zhì)聚合及形成抗菌物質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用。

3 討 論

作為水楊酸的類似物，BTH可誘導(dǎo)多種果蔬的采后抗病性[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，BTH可通過活化苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL，促進(jìn)代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累，提高POD和PPO的活力來促進(jìn)梨果實的愈傷和降低采后病害的發(fā)生。

苯丙烷代謝在植物愈傷中具有重要作用[17-18]。PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸[19]，傷口部位PAL的活力提高可促進(jìn)酚類物質(zhì)的積累，酚類物質(zhì)不僅可抑制病原菌通過傷口侵染果實[20]，又可參與愈傷組織的形成，抵御病原菌的侵入[21-22]。酚類物質(zhì)是合成木質(zhì)素的前體，木質(zhì)素是由肉桂醇、咖啡醇和芥子醇等木質(zhì)素單體聚合而成的致密復(fù)合物，是構(gòu)成愈傷組織的主要成分，總酚和木質(zhì)素含量的增加可促進(jìn)傷口修復(fù)。此外，愈傷還會誘導(dǎo)細(xì)胞分化形成特定的愈傷組織，從而使健康組織與受損位部位隔離，形成抵御外界病原物侵染的物理屏障[23-24]。類黃酮則是重要的植保素，在抑制病原物的擴(kuò)展中發(fā)揮了重要作用，類黃酮的產(chǎn)生速率和積累量常作為植物抗病性強弱的重要指標(biāo)[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)的BTH處理提高了梨?zhèn)诮M織中苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力的結(jié)果與前人采用BTH誘導(dǎo)鴨梨果實采后抗病性提高的結(jié)果[7]基本一致。

SOD是生物體內(nèi)唯一可以清除超氧陰離子的酶，可將超氧陰離子歧化為H2O2，而H2O2則參與了愈傷組織形成中細(xì)胞壁成分的氧化交聯(lián)，通過氧化交聯(lián)才可在傷口表面形成一層物理屏障，從而阻止水分的蒸發(fā)和防止病原物的侵入[26]。本研究中，BTH處理誘導(dǎo)了SOD活力的升高，增強其抗病性，該結(jié)果與Sparla等[27]采用水楊酸處理增強梨果實SOD活力的結(jié)果基本一致。PPO是廣泛存在于植物體內(nèi)的氧化酶類，能催化多酚類物質(zhì)氧化為醌類化合物[28]，醌對病原菌具有很高的毒性，可直接抑制病原菌的生長[29]。POD既是重要的抗氧化酶類，也是催化木質(zhì)素單體聚合形成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶，在愈傷組織的形成中具有關(guān)鍵作用。傷口部位POD的活力與愈傷組織的形成之間密切相關(guān)[30]。本研究中發(fā)現(xiàn)的BTH處理誘導(dǎo)了梨果實POD活力升高的結(jié)果與前人采用BTH誘導(dǎo)蘋果果實POD活力升高的結(jié)果[8]基本一致。

4 結(jié) 論

采后BTH處理可顯著促進(jìn)梨果實的愈傷和降低采后病害的發(fā)生。該作用機理與激活苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL活力，提高代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量密切相關(guān)。此外，BTH處理還提高了SOD、POD和PPO 3 種抗氧化酶的活力，這些酶活力的提高與H2O2供應(yīng)、細(xì)胞壁成分的氧化交聯(lián)和抗菌物質(zhì)的積累密切相關(guān)。

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