沈友明，聶繼云*，李志霞，李海飛，毋永龍，張建一

農(nóng)產(chǎn)品中的真菌毒素污染嚴(yán)重。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）統(tǒng)計(jì)，全球每年約有占總體25%（約10億 t）的糧食遭受真菌毒素污染[1]。真菌毒素是由病原真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其種類多、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各異、毒性廣泛。農(nóng)產(chǎn)品中重點(diǎn)關(guān)注的真菌毒素主要有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）、鏈格孢霉毒素、展青霉素（patulin，PAT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）、T-2毒素（trichothecenes，TS）、伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)Bs）等。這些毒素多具有神經(jīng)毒、致癌、致突變、致畸、免疫抑制等毒性。近年來，農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素污染嚴(yán)重影響了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和進(jìn)出口貿(mào)易，許多國家都投入了大量的資源開展其檢測(cè)技術(shù)、形成機(jī)理、消解規(guī)律、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究。

果品是重要的農(nóng)產(chǎn)品，也廣泛受到真菌毒素的污染[2]。水果田間生產(chǎn)和采收、貯運(yùn)、銷售、加工等環(huán)節(jié)與谷物類農(nóng)產(chǎn)品不盡相同，其真菌毒素的產(chǎn)生規(guī)律具有一定特殊性。真菌可輕易突破果皮的防御，并且水果含水量和水分活度高，理論上更利于真菌的增殖。果品中的真菌毒素主要有PAT、鏈格孢霉毒素、OTA和AF[3]。近年來，有關(guān)水果及果汁中PAT，蘋果、梨等水果中鏈格孢霉毒素，葡萄和葡萄酒中OTA，以及干果和堅(jiān)果中AF的研究報(bào)道較多，并在污染現(xiàn)狀、產(chǎn)毒菌株、毒理學(xué)性質(zhì)、生物合成途徑等方面有新的進(jìn)展[4-7]。本文綜述了近年來果品中4 種常見的真菌毒素的產(chǎn)毒菌株、理化性質(zhì)、污染情況、毒性毒理、產(chǎn)毒基因、合成途徑、影響因素等方面的研究進(jìn)展。

1 展青霉素

PAT又稱棒曲霉素，是一種主要由擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的內(nèi)酯類化合物。PAT主要由青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）產(chǎn)生，包括青霉，如擴(kuò)展青霉（P. expansum）、展青霉（P. patulum）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum）、灰黃青霉（P. griseofulvum）和曲霉，如棒曲霉（A. Clavalus）、土曲霉（A. terreus）、巨曲霉（A. giganteus）等[8-11]。PAT分子式為C7H6O4，系統(tǒng)名為4-羥基-4H-呋[3,2-c]吡喃-2（6H）-酮，具有呋喃并吡喃雜環(huán)的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，溶于水、氯仿、丙酮、乙醇、乙酸乙酯等溶劑，在酸性環(huán)境下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，在276 nm波長處有特征紫外吸收[12]。

PAT主要污染水果及其制品，尤以蘋果及其制品（特別是蘋果濃縮汁）的相關(guān)研究報(bào)道最多，檢出量可達(dá)數(shù)百μg/kg。其污染的水果主要有蘋果、山楂、柑橘、獼猴桃、櫻桃、藍(lán)莓、香蕉、草莓、葡萄等，水果制品有蘋果濃縮汁、山楂制品等[11,13-14]。PAT在受霉菌污染的蘋果、山楂、柑橘果實(shí)，蘋果濃縮汁及其飲料，蘋果及山楂的固體制品中可不同程度檢出[11,13-14]。例如，Sarubbi等[12]在共80 種蘋果漿和番茄漿產(chǎn)品中檢出PAT平均質(zhì)量濃度為7.15 μg/L；Bonerba等[15]在歐洲12 家果汁公司生產(chǎn)的共105 種蘋果濃縮汁、梨汁和混合果汁樣品中檢測(cè)到PAT陽性率為45%，其中蘋果汁質(zhì)量濃度范圍為6～30 mg/L，梨汁為5～92 mg/L，混合果汁為1～45 mg/L。目前，許多國家主要針對(duì)蘋果制品中規(guī)定了PAT的限量。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦蘋果濃縮汁中PAT限量為50 μg/L[16]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定以蘋果、山楂原料制成的產(chǎn)品中PAT限量為50 μg/kg[4]。歐盟制定蘋果汁及其他以蘋果為原料的飲料中PAT限量為50 μg/kg，固體蘋果制品中為25 μg/kg，以蘋果為原料的嬰幼兒食品中PAT限量為10 μg/kg[17]。我國GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[18]規(guī)定以蘋果、山楂為原料制成的產(chǎn)品（包括果汁飲料類和酒類）中PAT限量為50 μg/kg。

PAT具有急性毒性、致癌性、免疫和生殖毒性等多種較復(fù)雜的毒性作用[19-20]。藥物研發(fā)最初發(fā)現(xiàn)PAT具有與β-內(nèi)酰胺類抗生素相似的藥理活性，后續(xù)研究因其具有多種毒性而終止了藥物開發(fā)[21]。PAT具有較強(qiáng)的急性毒性，在嚙齒動(dòng)物中的半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）為20～100 mg/kg，在家雞中為50～170 mg/kg[11]。其急性毒性表現(xiàn)為胃腸道損傷、神經(jīng)癥狀（抽搐）、肺充血和水腫，亞急性表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、胃腸道變性、腎臟和神經(jīng)充血水腫[4,11]。PAT的致癌強(qiáng)度存在爭(zhēng)議，WHO認(rèn)為PAT是較強(qiáng)的基因毒性物質(zhì)；國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）認(rèn)為PAT對(duì)人的致癌性尚無法定論，將其定義為對(duì)人類的可疑致癌物質(zhì)[21]。PAT的致癌性在不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象中差異較大，其致癌性、致染色體畸變和致基因突變性在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中能取得陽性結(jié)果，但在細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中多為陰性結(jié)果。例如，PAT能導(dǎo)致小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞、V79細(xì)胞、FM3A細(xì)胞等多個(gè)細(xì)胞系染色體畸變和基因突變[4,22-23]，但僅在少數(shù)細(xì)菌如釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的Ames實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出致突變性，在其他多種細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中并無致突變或促進(jìn)突變作用[4,24]。PAT化學(xué)結(jié)構(gòu)中的內(nèi)?；鶊F(tuán)是與毒性有關(guān)的基團(tuán)，內(nèi)酰胺鍵能競(jìng)爭(zhēng)性地與某些體內(nèi)活性物質(zhì)或酶活性中心（如巰基）發(fā)生共價(jià)結(jié)合，繼而干擾正常新陳代謝[4,25]。PAT還可結(jié)合谷胱甘肽（glutathione，GSH）上的活性巰基，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH消耗和活性氧自由基濃度上升，從而產(chǎn)生毒性[26]。PAT還可通過交聯(lián)、產(chǎn)生核質(zhì)橋等機(jī)制影響微核形成，從而引起DNA結(jié)構(gòu)性損傷[27]。

PAT基因簇包含多個(gè)編碼PAT合成的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子[4,28-29]?；虼厥谴嬖谟谌旧w上結(jié)構(gòu)、功能相對(duì)獨(dú)立的片段，由多個(gè)功能相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子組成[4,28]。Artigot等[30]首先在棒曲霉和擴(kuò)展青霉菌株中發(fā)現(xiàn)與PAT合成相關(guān)的基因簇。棒曲霉菌株中的PAT基因簇是一個(gè)全長為41 kb的DNA片段，包含多個(gè)PAT合成酶和輔助因子，該基因簇包含與PAT合成相關(guān)的重要基因，包括6-甲基水楊酸（6-methylsalicylic acid，6-MSA）合成酶基因PatK、3-甲基酚羥化酶的基因PatH或PatI、異戊醇氧化酶的基因PatN（idh基因）等[31-33]。目前發(fā)現(xiàn)有15 個(gè)參與毒素合成的基因（圖1），其中，10 個(gè)基因編碼參與PAT合成的反應(yīng)酶，包括PatB、PatD、PatE、PatG、PatH、PatI、PatJ、PatK、PatO和PatN[4]。PatB、PatD、PatE 3 個(gè)基因編碼葡萄糖-甲醇-膽堿（glucose-methanol-choline，GMC）氧化還原聚合酶；PatG編碼6-MSA脫羧酶催化6-MSA脫去羧基生成3-甲基酚；PatH和PatI編碼細(xì)胞色素（cytochrome，CYP）氧化酶催化3-甲基酚羥化生成相應(yīng)的醇和醛；PatJ編碼一個(gè)雙加氧酶，功能暫未明確；PatK編碼6-MSA合成酶催化丙二酰CoA和乙酰CoA反應(yīng)生成6-MSA；PatO和PatN基因共同編碼異戊醇氧化酶（isoepoxydon dehydrogenase，IDH）[4,34]。另外，4 個(gè)基因編碼PAT合成過程的輔助因子，分別為PatL、PatM、PatC和PatA[4]。其中，PatL編碼的轉(zhuǎn)錄因子的N端含有Zn(Ⅱ)2Cys6家族鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[35]。Zn(Ⅱ)2Cys6家族是真菌特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是真菌次級(jí)代謝物生物合成過程中重要的調(diào)控因子[36-37]。PatM、PatC和PatA是3 個(gè)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因[4,32]。暫未發(fā)現(xiàn)PatF基因的功能，可能與該基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[4,32-33]。PAT經(jīng)聚酮類代謝物合成途徑，約經(jīng)歷10 步反應(yīng)合成（圖1）[4]。PAT合成反應(yīng)主要可分為以下步驟：3 分子丙二酰CoA和1 分子乙酰CoA在6-MSA合成酶催化下生成6-MSA；6-MSA在6-MSA脫羧酶催化下脫去羧基生成3-甲基酚；3-甲基酚在CYP氧化酶CYP619C2和CYP619C3共同催化下完成兩步氧化反應(yīng)生成龍膽醇或2,5-二羥基苯甲醛；繼而經(jīng)環(huán)氧化反應(yīng)最終生成PAT[4,33-34]。

PAT產(chǎn)生菌侵染是果品毒素殘留的先決條件。新鮮水果中基本無PAT殘留，但新鮮水果中多能分離得到青霉或曲霉等PAT產(chǎn)生菌[11,15]。PAT殘留多與水果腐爛有一定關(guān)系，在擴(kuò)展青霉引起的腐爛水果或腐爛部分的樣品中PAT陽性率和檢出濃度較高[11]。PAT對(duì)果汁及其制品污染的普遍性與果汁生產(chǎn)加工過程產(chǎn)毒真菌增殖有一定關(guān)系[11,38]。果汁生產(chǎn)過程，水果的組織結(jié)構(gòu)遭到破壞而失去保護(hù)力，導(dǎo)致產(chǎn)毒真菌增殖和產(chǎn)生毒素[38]。近年來，有關(guān)果品PAT的形成機(jī)制和控制技術(shù)研究較多。不同產(chǎn)PAT真菌具有不同的產(chǎn)毒能力[10-11]。擴(kuò)展青霉菌株在分離培養(yǎng)條件下具有較強(qiáng)的產(chǎn)毒能力，是蘋果和蘋果濃縮汁中主要的產(chǎn)毒菌[10-11]。在人工培養(yǎng)條件下，擴(kuò)展青霉的產(chǎn)毒能力受多種因素影響，主要有培養(yǎng)基中N元素和Mn元素濃度、水分活度、pH值和培養(yǎng)環(huán)境的溫度、紫外線等因素[39-41]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺素培養(yǎng)基中增加N元素和Mn元素，PAT合成多種關(guān)鍵酶的表達(dá)量和PAT產(chǎn)量都相應(yīng)增加[42]；另外，溫度、pH值、紫外線等也是影響PAT形成的因素[11,43]。蘋果濃縮汁生產(chǎn)過程中PAT的控制包括多個(gè)環(huán)節(jié)[44]。由于病原真菌侵染果實(shí)可發(fā)生在水果田間生產(chǎn)和采后各環(huán)節(jié)，理論上原料果不可避免地帶有產(chǎn)毒菌。因此，在原料準(zhǔn)備階段，應(yīng)當(dāng)控制果汁生產(chǎn)的原料果，盡量選擇種植條件良好、無病害的原料果，盡量選擇新鮮果，避免腐爛果、落地果。在果實(shí)貯藏階段，溫度、貯藏時(shí)間、氣調(diào)等均會(huì)影響果實(shí)的PAT殘留[45-46]?？傮w上貯藏溫度越接近0 ℃，增加CO2濃度或降低O2濃度都對(duì)PAT產(chǎn)生抑制作用[47]。在蘋果汁生產(chǎn)環(huán)節(jié)，PAT控制的關(guān)鍵點(diǎn)包括水洗、人工剔除腐爛果、防止原料腐爛、選擇合適的澄清與吸附劑等[47]。另外，運(yùn)用高能射線、活性炭處理、化學(xué)保護(hù)、巴氏殺菌、微生物降解等手段也可控制蘋果汁中PAT的產(chǎn)生[43,48]。

圖1 PAT的合成途徑和擴(kuò)展青霉中的PAT合成基因簇[4]Fig. 1 Biosynthetic pathway of patulin and clustered genes[4]

2 鏈格孢霉毒素

鏈格孢霉毒素是一類主要由鏈格孢霉產(chǎn)生的毒素。鏈格孢屬的互交鏈格孢菌是主要侵染菌和產(chǎn)毒菌，可引起果蔬田間和采后病害，及毒素殘留[8,49]。果品中鏈格孢霉毒素主要由鏈格孢屬（Alternaria）產(chǎn)生，包括交鏈格孢（A. alternata）、柑橘鏈格孢（A. citri）、細(xì)交鏈格孢（A. tenuis）、茄鏈格孢（A. solani）和其他霉菌如稻梨孢（P. oryzae）、黃灰青霉（P. aurantiogriseum）、黃青霉（P. chrysogenum）等[50-51]。目前已分離鑒定的鏈格孢霉毒素超過30 種，關(guān)注和研究較多的包括細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、互隔交鏈孢酚（alternariol，AOH）、交鏈孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、騰毒素（tentoxin，Ten）、互隔交鏈孢霉素（altenuene，ALT）和交鏈孢毒素（altertoxin，ATX）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ[49,52]。鏈格孢霉毒素具有多種母核結(jié)構(gòu)，其中AOH、AME、ALT屬于苯并吡喃酮衍生物；ATXⅠ、ATXⅡ、ATX III屬于二萘嵌苯類衍生物；TeA屬于吡咯烷-2,4-二酮類衍生物；ALT毒素具有長鏈氨基多元醇的丙三羧酸酯類結(jié)構(gòu)；Ten具有環(huán)形四肽結(jié)構(gòu)[49,52]。

鏈格孢霉毒素主要污染的果蔬有蘋果、梨、柑橘、葡萄、草莓、藍(lán)莓、芒果、西紅柿等，在腐爛樣品中檢出濃度較高[53-55]。其中，TeA、AOH和AME在果品的陽性率和檢出濃度較高[54]。例如，蔣黎艷等[55]測(cè)定柑橘樣品中ALT、AME、AOH、TeA和Ten，陽性率為25%，含量范圍為2.1～21.8 μg/kg；van de Perre等[53]測(cè)定阿根廷的藍(lán)莓、樹莓和黑莓樣品中AME和AOH含量范圍為13.0～22.2 μg/kg。López等[56]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無花果干中TeA含量高達(dá)1 728 μg/kg。如今，鏈格孢霉毒素毒理學(xué)、膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)及評(píng)估尚處于資料積累階段，尚無國家對(duì)鏈格孢霉毒素制定限量標(biāo)準(zhǔn)。

鏈格孢霉毒素對(duì)人和動(dòng)物有急性毒性、致癌、致畸、致突變性等多種毒性。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道，我國河南省林縣食道癌持續(xù)高發(fā)的原因可能與該地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品中鏈格孢霉毒素污染有關(guān)[57-58]。鏈格孢真菌培養(yǎng)物對(duì)小鼠、雞、雞胚等有急性毒性、致畸性、胚胎毒性，并且培養(yǎng)物在Ames實(shí)驗(yàn)中對(duì)TA98菌株有致突變性[59]。后續(xù)對(duì)毒素進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)確定的研究發(fā)現(xiàn)，TeA是在果品中濃度較高和在動(dòng)物體內(nèi)毒性作用較強(qiáng)的一種[59]。TeA在多種動(dòng)物、細(xì)胞、細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的急慢性毒性、致癌性、細(xì)胞毒性等[55,60]。動(dòng)物急性和亞急性毒性表現(xiàn)為多器官出血、水腫等病理變化，并表現(xiàn)為食物利用率下降，體質(zhì)量增加緩慢[59]。TeA對(duì)某些植物同樣有毒性作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的除草劑活性[61]。相關(guān)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TeA能干擾核糖體上肽鏈合成，其影響終止過程，使得合成完畢的肽鏈不能夠脫離核糖體，從而干擾蛋白質(zhì)合成[55]。AOH、AME和ALT不具有明顯的急性毒性，但具有較強(qiáng)的致突變性和生殖毒性[59,62-63]。AOH和AME能夠?qū)е陆Y(jié)腸癌HT-29細(xì)胞DNA在復(fù)制過程中發(fā)生斷裂[64]。AOH在V79細(xì)胞和小鼠淋巴瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II活性的抑制作用，其致突變性約為強(qiáng)致突變物質(zhì)4-硝基喹啉-N-氧化物的1/50[62-63]。AOH的致突變機(jī)理可能是通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II活性，使得DNA在復(fù)制過程中拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致DNA不能正常復(fù)制[62-63]。ATXs具有較強(qiáng)的急性毒性和Ames致突變性，并且在人淋巴瘤Raji細(xì)胞株上表現(xiàn)出促癌作用[62-63]。

鏈格孢霉毒素可能經(jīng)聚酮途徑合成，具體途徑尚不明確。研究表明，聚酮化合物合成酶（polyketide synthases，PKS）是鏈格孢霉毒素重要的合成酶[65-66]。Yun等[67]在水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中發(fā)現(xiàn)TeA合成酶（TeA synthetase，TAS）1編碼基因序列號(hào)為MGG_07803。TAS1是具有非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）功能和PKS功能的聚合酶，在催化異亮氨酸和乙酰乙酰CoA形成TeA過程中起重要作用[67]。Chooi等[68]研究表明SnPKS19（SNOG_15829）基因編碼的PKS是Parastagonospora nodorum菌合成AOH和AME關(guān)鍵酶。

水果鏈格孢霉毒素殘留多與貯藏中鏈格孢菌侵染有一定關(guān)系[53-55]。鏈格孢菌中的互交鏈格孢菌（A. alternata）是水果田間和采后主要的產(chǎn)毒菌[69-72]。此外，互交鏈格孢菌株可引起作物田間和采后病害[73]。研究發(fā)現(xiàn)，在不同植物種類樣品中分離到的互交鏈格孢菌具有遺傳特異性，屬于不同菌株，可產(chǎn)生宿主特異的植物毒素（host-specific toxins，HSTs），稱為鏈格孢菌的寄主選擇性[74-75]。Lengi[74]、Deng Jianxin[75]等發(fā)現(xiàn)日本梨的AK-毒素、柑橘的ACT-毒素和草莓的AF-毒素是鏈格孢菌產(chǎn)生的具有酯化癸三烯酸類似結(jié)構(gòu)的HSTs。互交鏈格孢菌感染多發(fā)生在水果采前階段，在采后貯藏中，果實(shí)因失去人為保護(hù)或貯藏時(shí)間過長等原因，引起產(chǎn)毒真菌增殖造成病害或形成真菌毒素。在人工培養(yǎng)條件下，鏈格孢霉毒素的產(chǎn)生除與互交鏈格孢菌株產(chǎn)毒能力差異有關(guān)外，還受到培養(yǎng)基中的水分活度、pH值、培養(yǎng)溫度等因素影響[53]。Oviedo等[76]在15～34 ℃和0.95～0.98水分活度范圍內(nèi)進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究了水分活度和溫度對(duì)極細(xì)鏈格孢菌（A. tenuissima）產(chǎn)生ATX II的影響，發(fā)現(xiàn)在溫度為30 ℃、水分活度為0.98時(shí)極細(xì)鏈格孢菌產(chǎn)生ATX II能力較強(qiáng)。

3 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是由曲霉和青霉屬的某些真菌產(chǎn)生的毒素[7,77]。赭曲霉毒素主要的產(chǎn)生菌包括曲霉屬中的炭黑曲霉（A. carbonarius）、黑曲霉（A. niger）、赭曲霉（A. ochraceus）、寄生曲霉（A. parasiticus）和青霉屬菌株中的疣孢青霉（P. verruculosum）、純綠青霉（P. polonicum）、變幻青霉（P. variabile）和產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum）等[7,77]。目前發(fā)現(xiàn)，具有明顯毒性的赭曲霉毒素有7 種，關(guān)注較多的包括OTA、赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB）、赭曲霉毒素C（ochratoxin C，OTC）等[7]。其中，OTA毒性最大，被WHO和IARC歸為2B類致癌物。OTA的分子式是C20H18ClNO6，具有異香豆素化合物的聚酮類化合物類似結(jié)構(gòu)，微溶于水，有較強(qiáng)的化學(xué)和熱穩(wěn)定性[9]。

OTA主要污染谷物類農(nóng)產(chǎn)品，其次污染葡萄及葡萄制品如葡萄干、葡萄汁、葡萄酒等[78-79]。OTA污染的果品還包括開心果、花生、無花果干、杏干等[7]。例如，Akdeniz等[80]研究了土耳其葡萄制品的OTA污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄干、葡萄果汁和葡萄酒樣品污染陽性率分別為8%、20%、88%，其中OTA平均含量分別為1.15、1.40、2.04 μg/kg。鑒于OTA的強(qiáng)毒性和污染嚴(yán)重性，許多個(gè)國家對(duì)谷物、葡萄及葡萄制品中OTA進(jìn)行了限量規(guī)定。國際葡萄和葡萄酒組織（International Organisation of Vine and Wine，OIV）規(guī)定葡萄酒中OTA限量為2 μg/kg。歐盟和加拿大對(duì)葡萄酒、葡萄汁和葡萄干中OTA限量分別為2、2、10 μg/kg[81-82]。我國GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定了以谷物、豆類和其為原料制成產(chǎn)品的OTA限量為5 μg/kg，并未對(duì)葡萄制品中OTA進(jìn)行限定[18]。

OTA對(duì)動(dòng)物和人都具有多方面的毒性，包括致癌、致畸、神經(jīng)毒性、腎毒性等[25]。OTA是較強(qiáng)的致癌物質(zhì)，可導(dǎo)致DNA損傷和多位點(diǎn)甲基化[80,83]。OTA有很強(qiáng)的急性毒性，在犬、家豬、家雞中LD50分別為0.2、1.0、3.3 mg/kg，在小鼠、大鼠中的LD50在20～58 mg/kg范圍內(nèi)[25]。在OTA亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激、血漿參數(shù)改變和腎臟組織病變[80]。由于OTA化學(xué)結(jié)構(gòu)與苯丙氨酸相似，其在體內(nèi)可與苯丙氨酸競(jìng)爭(zhēng)而干擾某些代謝反應(yīng)[80]。Darif等[83]研究結(jié)果表明OTA可干擾以苯丙氨酸為底物的酶促反應(yīng)和蛋白質(zhì)合成反應(yīng)等，并且OTA能夠?qū)е戮€粒體過氧化和加速細(xì)胞凋亡。

OTA經(jīng)聚酮類化合物合成途徑合成，具體過程還未明確。OTA合成途徑與異香豆素類似物相似，是以L-苯丙氨酸為底物的聚酮化合物途徑合成[84]。OTA合成過程涉及幾種重要的酶，包括PKS、NRPS、鹵化酶、CYP450單加氧酶、酯酶等[84-85]。Gil-Serna等[86]研究了曲霉菌中OTA合成基因，發(fā)現(xiàn)毒素合成的3 個(gè)關(guān)鍵酶（PKS、NRPS、CYP450單加氧酶）基因位于一條連續(xù)長度為20 742 bp的DNA鏈。AcOTApks是編碼PKS的基因，在OTA合成的起始階段起重要作用[7,85,87]。AcOTAnrps基因編碼的NRPS，在催化異香豆素和L-β-苯丙氨酸的肽鍵形成OTB過程起關(guān)鍵作用[88]。OTB是OTA的前體，OTB可能經(jīng)AcOTAhal基因編碼的鹵化酶完成其結(jié)構(gòu)中C-5位置的鹵化催化形成OTA[88]。另外兩個(gè)基因AcOTAp450和AcOTAbZIP可能在毒素合成過程中起著酶或者輔助因子作用[88]。

近年來，有關(guān)果品中OTA形成的影響因素研究取得了一定的進(jìn)展。OTA主要的產(chǎn)生菌是曲霉和青霉，但在作物和地域上有各自的優(yōu)勢(shì)菌[7]。Wang Yan等[7]列舉了21種能產(chǎn)生OTA的曲霉和青霉，并總結(jié)出曲霉屬真菌是溫室內(nèi)或溫帶地區(qū)OTA的主要產(chǎn)生菌，而青霉屬真菌是較冷地區(qū)OTA產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，谷物中OTA可能由赭曲霉（A. ochraceus）和疣孢青霉（P. verruculosum）產(chǎn)生，但水果及果汁、可可豆和咖啡中OTA可能主要是由碳黑曲霉（A. carbonarius）和黑曲霉（A. niger）產(chǎn)生[78-79]。影響OTA形成的因素有光照、氧化脅迫、pH值、滲透壓、氮源等。光照對(duì)產(chǎn)毒真菌繁殖和毒素形成的影響比較復(fù)雜。Schmidt-Heydt等[89]在多種產(chǎn)OTA菌培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，高波長紅光（627 nm）和低波長藍(lán)光（470～455 nm）對(duì)OTA的形成有抑制作用。Cheong等[90]也得出了類似結(jié)果，并總結(jié)出黑色素含量較高的菌株對(duì)光照的敏感性不及黑色素含量較低的菌株，培養(yǎng)基種類可對(duì)真菌的光照敏感性造成影響。真菌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)也影響OTA合成。氧脅迫調(diào)控因子（activator protein，AP）-1是細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用，具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活活性[7,91]。研究表明，敲除真菌Aoyap1基因，將導(dǎo)致真菌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，并影響毒素產(chǎn)生[7,91]。另外，pH值、滲透壓、氮源等因素可影響OTA的生成[7,92-93]。

4 黃曲霉毒素

AF主要由曲霉屬中黃曲霉（A. flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）菌株產(chǎn)生[8]。目前已分離鑒定的AF有17 種，關(guān)注較多的包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等[94]。AFM1、AFM2是由AFB1、AFB2在人或動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化形成，主要污染肉、奶等動(dòng)物制品[94]。AFB1是毒性最大的一種，被WHO和IARC劃定為1類致癌物。AFB1具有二呋喃環(huán)并香豆素結(jié)構(gòu)，分子式為C17H12O6，具有很強(qiáng)化學(xué)和熱穩(wěn)定性，需280 ℃以上長時(shí)間處理才能破壞其結(jié)構(gòu)。

AF可對(duì)多種農(nóng)產(chǎn)品包括玉米、水稻、花生、小麥、大豆、堅(jiān)果類等及其制品造成污染[87]。在果品中，AF主要污染花生、核桃、開心果、榛子、杏仁、葡萄干、無花果干等。AF在干果和堅(jiān)果中陽性率較高，檢出量可達(dá)幾百μg/kg[25,95-96]。AF對(duì)人類危害巨大，如今許多國家對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中AF進(jìn)行了嚴(yán)格限量規(guī)定，范圍為0.05～30.00 μg/kg[97-98]。針對(duì)干果和堅(jiān)果制品，國際食品法典委員會(huì)頒布的CODEX STAN 193—2010規(guī)定：4 種AF（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）在杏仁、巴西堅(jiān)果、榛子和開心果初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品中總限量為15 μg/kg，在即食產(chǎn)品中限量為10 μg/kg[98]。歐盟標(biāo)準(zhǔn)No 1881/2006及其修訂版規(guī)定：開心果、巴西堅(jiān)果、榛子等中4 種AF（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）總限量為10～15 μg/kg，其中AFB1限量為5～12 μg/kg不等；即食產(chǎn)品中AF和AFB1限量分別為4～10 μg/kg和2～8 μg/kg[17,81,99]。FDA標(biāo)準(zhǔn)CPG Sec. 570.375規(guī)定巴西堅(jiān)果、開心果AF總量限量為20 μg/kg[100]。我國GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定除花生外的其他熟制堅(jiān)果及籽類AFB1限量為5 μg/kg[18]。

AFB1具有急性毒性、致癌、致畸、致突變、免疫抑制等毒性。AFB1短時(shí)間暴露對(duì)人和動(dòng)物有很強(qiáng)的急性、亞急性毒性作用。AFB1的LD50在多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)的范圍為0.3～17.9 mg/kg，屬于劇毒類物質(zhì)。AFB1的主要急性毒性是導(dǎo)致肝損傷，包括肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，肝臟腫脹、出血、壞死、變性等；亞急性毒性主要體現(xiàn)在肝硬化、膽管增生、胃腸道紊亂、貧血等[101]。AFB1長時(shí)間暴露有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變、免疫抑制、營養(yǎng)紊亂等毒性作用[101-102]。AFB1具有致癌性主要原因是其被肝臟藥物代謝酶活化形成活性代謝產(chǎn)物，繼而破壞DNA結(jié)構(gòu)和影響其功能。目前認(rèn)為，AFB1通過細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP3A4）代謝產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物為8,9-外環(huán)氧AFB1（exo-8,9-epoxide AFB1，exo-AFBO）[8,101-102]?；钚援a(chǎn)物exo-AFBO能夠與DNA發(fā)生親核反應(yīng)，形成AFB1-DNA加合物，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而促進(jìn)或?qū)е掳┳僛8,101]。研究表明，AFB1還可引起抑癌基因p53突變和癌基因ras激活[103]。

AF合成基因簇位于真菌第3號(hào)染色體上（圖2）[29,104]。寄生曲霉AF合成基因簇基因序列號(hào)為YA341790。AF合成基因簇包括約25 個(gè)基因，總長度約為80 kb?；騛flA～aflY是已經(jīng)克隆得到的可能與AF合成有關(guān)的基因。其中，aflA～aflQ已經(jīng)明確具有催化功能的基因；aflT～aflY具體作用并不明確。AflR和aflS基因是重要的調(diào)控因子[105]。AflR基因是寄生曲霉和黃曲霉AF合成基因簇中的必需基因，在多數(shù)AF產(chǎn)生菌株中具有高度同源性[106-108]。AflR基因編碼具有Zn(Ⅱ)2Cys6結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異地識(shí)別啟動(dòng)子序列（5-TCGN5CGR-3），對(duì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄有重要作用[109-110]。AflR基因高表達(dá)可提高毒素生物合成途徑中其他基因（如aflF）的表達(dá)水平，從而增加AFB1的合成量[105]。相反，AflR基因缺失可能導(dǎo)致不能合成AF[29,111]。AF合成約需20 步反應(yīng)過程，經(jīng)歷聚酮合成途徑。AF合成是以乙酰CoA為底物，在一系列酶催化下形成具有復(fù)合雜環(huán)結(jié)構(gòu)的聚酮骨架化合物（圖2）[29]。合成反應(yīng)起始是由aflA和aflB基因編碼的α亞基和β亞基共同組成脂肪酸合成酶催化乙酰-CoA形成己酰-CoA；己酰-CoA再由aflC編碼的PKS催化生成諾素羅瑞尼克酸（norsolorinic acid，NOR）；NOR被aflE編碼的還原酶和aflF編碼的脫氫酶催化生成奧佛蘭提素（averantin，AVN）；AVN經(jīng)一個(gè)由aflG基因編碼的CYP450酶（ord-1）催化生成奧佛路凡素（5’-hydroxyaverantin，HAVN）；HAVN經(jīng)aflH編碼的醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，adhA）脫氫催化生成奧佛尼紅素（averufin，AVF）；AVF經(jīng)aflI編碼的氧化酶催化生成雜色半縮醛乙酸（versiconal hemiacetal acetate，VHA）；VHA經(jīng)aflJ編碼的酯化酶催化生成雜色醇（versiconal，VAL）；VAL經(jīng)aflK編碼的雜色曲霉B合成酶催化生成雜色曲霉B（versicolorin B，VERB）；VERB經(jīng)aflL編碼的CYP450單加氧酶催化生成雜色曲霉A（versicolorin A，VERA）；VERA經(jīng)aflM和aflN編碼的脫氫酶和CYP450單加氧酶催化生成去甲基柄曲霉素（demethylsterigmatocystin，DMST）；DMST經(jīng)aflO編碼的O-甲基轉(zhuǎn)移酶I催化生成柄曲霉素（sterigmatocystin，ST）；ST經(jīng)aflP編碼的O-甲基轉(zhuǎn)移酶II催化生成O-甲基柄曲霉素（O-methylsterigmatocystin，OMST）；OMST經(jīng)aflQ編碼的單加氧酶催化最終生成AFB1[29,97,110]。OMST可能經(jīng)aflQ編碼的單加氧酶，或aflY編碼的還原酶和NorB編碼的脫氫酶共同催化最終生成AF[112]。

近年來，有關(guān)果品中AF產(chǎn)生的影響因素和控制手段研究較多。研究表明，不良的貯藏環(huán)境條件是AF污染的主要因素，包括溫度、水分活度和CO2濃度。貯藏條件的溫度和水分活度是對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒影響較大的因素。Arrus等[113]以巴西堅(jiān)果為培養(yǎng)基，在相對(duì)濕度為75%、80%、85%、97%和溫度為10、13、15、25、30 ℃條件下設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在相對(duì)濕度為97%、溫度為25 ℃和30 ℃時(shí)AF總量和AFB1含量分別達(dá)到6 817 μg/kg和4 483 μg/kg。另外，水分活度和溫度影響AF調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。Gallo等[114]以杏仁作為培養(yǎng)基，研究水分活度（0.90、0.93、0.96、0.99）和溫度（20、28、37 ℃）對(duì)黃曲霉的產(chǎn)毒性能的研究中發(fā)現(xiàn)，水分活度在0.90、0.93時(shí)無真菌生長和AFB1的產(chǎn)生，在水分活度0.96和28 ℃條件下AFB1產(chǎn)生最多，在28 ℃條件下調(diào)節(jié)基因aflR和aflS的表達(dá)量較高，在28 ℃和水分活度為0.96、0.99時(shí)結(jié)構(gòu)基因aflD和aflO表達(dá)量較高。Lahouar等[115]在溫度15～37 ℃、水分活度0.85～0.99范圍條件下進(jìn)行研究，結(jié)果表明溫度在37 ℃和水分活度在0.97～0.99時(shí)黃曲霉生長速率較快，但水分活度低于0.91時(shí)黃曲霉將不能生長。CO2濃度升高同樣影響黃曲霉生長和AF形成。Giorni等[116]研究表明，CO2體積分?jǐn)?shù)升高到25%時(shí)將抑制黃曲霉生長，升高到50%及以上時(shí)AF合成受到明顯抑制。AF控制手段還有生防菌、化學(xué)物質(zhì)、物理射線等。生防菌或毒素降解酶同時(shí)培養(yǎng)可能抑制黃曲霉或AF形成，如培養(yǎng)基中添加降解酶、釀酒酵母、少孢根霉菌、乳酸桿菌能抑制黃曲霉生長或AF形成[117-119]。有關(guān)化學(xué)物質(zhì)抑制黃曲霉生長或AF形成的報(bào)道較多，這些化學(xué)物質(zhì)包括抗真菌劑、花青苷、黃酮、多酚類物質(zhì)、類胡蘿卜素、水飛薊素等[117,120-122]。多種物理處理能降低農(nóng)產(chǎn)品中的AF含量，如水洗和吸附等處理能降低AF含量，γ射線輻照能導(dǎo)致AFB1降解[123-124]。

圖2 AF的合成基因簇結(jié)構(gòu)和AF的合成途徑[29]Fig. 2 Clustered genes involved in biosynthetic pathway of aflatoxins[29]

5 結(jié) 語

真菌毒素嚴(yán)重危害人類健康，其在果品中的殘留嚴(yán)重影響果品質(zhì)量安全。研究發(fā)現(xiàn)，果品中的真菌毒素主要有PAT、鏈格孢霉毒素、OTA和AF。上述毒素對(duì)人體具有廣泛毒性，在水果及其制品的產(chǎn)毒菌株、污染情況、毒性毒理、合成途徑及其影響因素各有不同。PAT主要污染蘋果、山楂及其制品，是由青霉和曲霉屬菌株經(jīng)聚酮途徑合成，涉及到多種酶與底物反應(yīng)，并受到多種因素影響。鏈格孢霉是引起多種水果蔬菜病害和產(chǎn)生鏈格孢霉毒素的主要病菌。在果品中TeA、AOH、AME和ALT是主要?dú)埩舻逆湼矜呙苟舅?。OTA是2B類致癌物，主要污染葡萄及其制品。AF污染干果、堅(jiān)果等。AFB1是第1類致癌物，其合成過程已經(jīng)比較明確。本文總結(jié)了相關(guān)基礎(chǔ)理論，期望對(duì)果品中真菌毒素研究領(lǐng)域科研人員提供一定參考。

真菌毒素合成途徑、影響因素及調(diào)控機(jī)理的生化和分子生物學(xué)將是今后真菌毒素研究重點(diǎn)內(nèi)容之一。綜述發(fā)現(xiàn)，真菌毒素的發(fā)生規(guī)律、毒素合成的影響因素與控制機(jī)理是真菌毒素防控技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵，但相關(guān)機(jī)理還不完全清楚。前期研究表明，真菌毒素的產(chǎn)毒物質(zhì)基礎(chǔ)、合成途徑和影響因素比較復(fù)雜；真菌毒素基因表達(dá)調(diào)控可能發(fā)生在多個(gè)層次，并受多因素和多調(diào)控組分控制。目前，多種真菌毒素合成生化通路的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理尚未完全闡明。因此，真菌毒素的合成途徑、基因調(diào)控、環(huán)境影響因素及機(jī)理將成為今后的研究熱點(diǎn)。

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