吳婉儀,李 璐,解新安,李 雁

(華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

蝦青素(Astaxanthin)屬于非維生素A類源胡蘿卜素,具有很強的抗氧化活性和多種保健功能,如抗衰老、防癌變、增強機體免疫、維護中樞神經系統(tǒng)等[1-2],在保健品、化妝品等工業(yè)中有較為廣泛的應用[3]。但由于其水溶性和穩(wěn)定性較差,遇到光、熱、氧氣等極易被氧化分解,生物利用度低,所以對蝦青素的保護和有效應用己成為眾多研究者關注的問題[4-5]。

載體包埋技術可以用來改善天然蝦青素的水分散性和穩(wěn)定性,如納米沉淀技術[6]、微膠囊包埋技術[7]、納米乳液技術[8]等。區(qū)別于納米沉淀技術的有機溶劑殘留,生物相容性、生物可降解性、毒性等問題,以及工業(yè)生產常用的高溫噴霧干燥微膠囊包埋技術不適用于對熱不穩(wěn)定的營養(yǎng)活性物質,納米乳液作為一種膠體輸送系統(tǒng)具有更高的穩(wěn)定性[9-10],且通過高能外力包封納米乳液后,脂溶性營養(yǎng)成分的生物利用率得到了顯著提升[11],然而將納米乳液用于蝦青素包埋和保護的研究相對較少[12]。在制備納米乳液的過程中,許多食品級的生物兼容性強的生物大分子乳化劑逐漸成為化學合成乳化劑很好的替代品[13-14],大豆卵磷脂是從大豆中提煉出來的具有多種保健功能的天然食品乳化劑,已被廣泛應用于食品工業(yè)[15],但以其作為乳化劑構建納米乳液的研究少見報道。

本研究以大豆卵磷脂為乳化劑,棕櫚油為油相,采用高壓均質法制備負載蝦青素的納米乳液,系統(tǒng)研究大豆卵磷脂乳化劑的添加濃度、乳化溫度和乳化時間、以及油水比等單因素對所得乳液粒徑和負載量的影響,并通過響應面法優(yōu)化納米乳液制備條件,以制備出負載率高、穩(wěn)定性好的蝦青素納米乳液。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

大豆卵磷脂、棕櫚油、蝦青素標品(純度≥98%) 均購自廣東齊云生物技術有限公司;2,6-叔丁基對甲酚(BHT) 購自廣州市雨韶貿易有限公司;二氯甲烷、二甲基亞砜、正己烷、無水乙醇 均購自廣東光華科技股份有限公司。

Millipore超純水系統(tǒng) 法國Millipore公司;scientz-150型高壓均質機 寧波新芝生物科技股份有限公司;FJ200型高速分散均質攪拌器 上海弗魯克流體機械制造有限公司;UV-2500型紫外可見分光度計 德國斯派克分析儀器公司;Zetasizer Nano ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦青素納米乳液的制備 在一定乳化溫度下將一定量的大豆卵磷脂在一定乳化時間內溶解于去離子水中,之后在室溫下攪拌過夜,使其充分水化,制得水相。取一定量的蝦青素與棕櫚油攪拌混勻,然后將蝦青素油相與水相按不同的比例混合攪拌均勻后在高速分散機上以18000 r/min分散4 min制得粗乳液,再將制得的粗乳液在不同高壓均質壓力下均質不同次數,得到相應的蝦青素納米乳液。將制備好的乳液于4 ℃冰箱冷藏保藏。為了在貯藏中抑制乳液中微生物的生長,在乳液的油相與水相混合時加入0.02%(w/w)BHT抗氧化劑。

1.2.2 單因素實驗 采用1.2.1法制備蝦青素納米乳液,進行單因素實驗,考察以下因素對蝦青素納米乳液的性能影響。

1.2.2.1 乳化溫度 固定制備條件為乳化時間45 min、高壓均質壓力及循環(huán)次數為110 MPa 3次、乳化劑濃度1%、油水比1∶9、蝦青素添加量0.1%,考察不同乳化溫度(35、45、55、65、75 ℃)對乳液粒徑及蝦青素負載率的影響。

1.2.2.2 乳化時間 固定制備條件為乳化溫度55 ℃、高壓均質壓力及循環(huán)次數為110 MPa 3次、乳化劑濃度1%、油水比1∶9、蝦青素添加量0.1%,考察不同乳化時間(15、30、45、60、75 min)對乳液粒徑及蝦青素負載率的影響。

1.2.2.3 高壓均質壓力及循環(huán)次數 固定制備條件為乳化溫度55 ℃、乳化時間45 min、乳化劑濃度1%、油水比1∶9、蝦青素添加量0.1%,考察不同高壓均質壓力(65、80、95、110 MPa)及循環(huán)次數(1、3、5、7次)對乳液粒徑的影響。

1.2.2.4 乳化劑濃度 固定制備條件為乳化溫度55 ℃、乳化時間45 min、高壓均質壓力及循環(huán)次數為110 MPa 3次、油水比1∶9、蝦青素添加量0.1%,考察不同乳化劑濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對乳液粒徑及蝦青素負載率的影響。

1.2.2.5 油水比 固定制備條件為乳化溫度55 ℃、乳化時間45 min、高壓均質壓力及循環(huán)次數為110 MPa 3次、乳化劑濃度1%、蝦青素添加量0.1%,考察不同油水比(1∶13、1∶11、1∶9、1∶7、1∶5，w/w)對乳液粒徑及蝦青素負載率的影響。

1.2.2.6 蝦青素添加量 固定制備條件為乳化溫度55 ℃、乳化時間45 min、高壓均質壓力及循環(huán)次數為110 MPa 3次、乳化劑濃度1%、油水比1∶9,考察不同蝦青素添加量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%)對乳液粒徑及蝦青素負載率的影響。

1.2.3 Box-Benhnken中心組合實驗設計 納米乳液體系配方的設計原則為使用最少的乳化劑乳化最大量的油脂量,并期望得到較高的蝦青素負載量。在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken設計優(yōu)化高壓均質法制備蝦青素納米乳液的工藝條件,基于納米乳液體系配方設計原則及能耗考慮,選取乳化劑濃度(A)、油水比(B)、蝦青素添加量(C)3個因子作為實驗因素,以粒徑(Y1)和負載率(Y2)作為響應值。將單因素選出來的最佳值定位0水平,因素水平表如表1所示。

表1 響應面實驗因素水平編碼表

1.2.4 納米乳液粒徑的測定 采用納米粒度儀測量納米乳液平均直徑大小和多分散系數(PDI),測定溫度固定在25 ℃,所有的乳液均使用去離子水稀釋100倍后再進行檢測,實驗重復3次,取均值。

1.2.5 納米乳液中蝦青素含量的測定

1.2.5.1 蝦青素標準曲線的繪制 用二氯甲烷溶液溶解蝦青素,通過紫外-可見光分光光度計在400～600 nm波長范圍內掃描,吸收圖譜顯示在477 nm處有明顯的吸收峰。使用少量二氯甲烷溶解蝦青素標品,以正己烷為溶劑配制質量濃度為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL不同濃度的蝦青素標準溶液,繪制蝦青素標準曲線為A=0.0484C-0.0875,相關系數r=0.9994。

1.2.5.2 納米乳液中蝦青素負載率和保留率的測定 負載率和保留率是評定負載功能性營養(yǎng)成分納米乳液質量的重要指標,負載率反映的是蝦青素被乳液負載的程度,而保留率為蝦青素納米乳液在貯藏過程中蝦青素的保留程度。根據杜有功[16]的方法稍有改動,準確量取0.5 mL納米乳液與0.5 mL二甲基亞砜混合均勻,然后依次加入2 mL正己烷-二氯甲烷(3∶1,v/v)混合溶劑進行提取,重復提取3次后合并萃取液,在4000 r/min下離心10 min,取上層清液測其吸光值,根據標準曲線計算蝦青素質量濃度。通過公式(1)計算蝦青素的負載率:

式(1)

式中:C1為納米乳液中蝦青素的濃度;C0為納米體系中加入蝦青素總濃度。

通過公式(2)計算蝦青素的保留率:

式(2)

式中:C3為一定貯藏時間后納米乳液中蝦青素的濃度;C2為貯藏前乳液負載的蝦青素濃度。

1.3 數據處理

所有實驗至少重復三次并采用平均值,采用Origin 8.5軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乳化溫度對蝦青素納米乳液的性能影響 選擇合適的乳化溫度對形成粒徑較小且均一的納米乳液具有重要影響,由圖1(a)可知,當乳化溫度在35～75 ℃之間時,納米乳液粒子的粒徑先減小,在溫度為55 ℃時納米乳液粒子粒徑達到最小,當溫度繼續(xù)升高時,納米乳液液滴的粒徑呈現(xiàn)增加的趨勢。這可能是由于乳化溫度較低時,分子的空間位阻作用使乳化劑分子動能受限,界面吸附的乳化劑分子較少,不利于乳化。溫度的提升可以幫助降低界面張力及粘度,使乳化反應易于進行,但當乳化溫度過高時,乳化劑分子具有較高的熱動能,乳化反應的速度和不穩(wěn)定性則會加速[17]。而乳液粒徑的PDI值均較小,說明了制備的乳液粒徑分布均一。由圖1(b)可知,受到乳化劑的影響,在35～55 ℃范圍內,隨著乳化溫度的上升,蝦青素負載率增加,而溫度持續(xù)上升時,負載率開始下降。因此選定乳化溫度為55 ℃,在此溫度下乳化劑的乳化效果最佳。

圖1 不同乳化溫度下納米乳液的平均粒徑和分散系數(a)、蝦青素負載率(b)

2.1.2 乳化時間對蝦青素納米乳液的性能影響 乳化時間影響乳化劑的乳化效果,如圖2(a),在乳化時間為15～45 min,增加乳化時間有助于得到更小粒徑的乳液液滴,在乳化時間為45 min時粒徑達到最小,隨著乳化時間的繼續(xù)增加粒徑轉為增大。對于乳液粒徑的PDI值,在適宜的乳化時間范圍下較小,說明了其粒徑的分布越窄。由圖2(b)可知,蝦青素負載率在對應的乳化時間范圍內,隨著乳化時間的增加,負載率先增加后減小,在45 min時達到最大。因此選定乳化時間為45 min。

圖2 不同乳化時間下納米乳液的平均粒徑和分散系數(a)、蝦青素負載率(b)

2.1.3 高壓均質壓力及循環(huán)次數對蝦青素納米乳液的性能影響 高壓均質法制備納米乳液時,粗乳液粒子在巨大的剪切、碰撞和空穴效應的作用下,粒徑逐漸減小,其中高壓均質壓力大小和循環(huán)次數是制約納米乳液粒子大小的決定性因素,而對功能性營養(yǎng)物質的負載率影響較小[18]。由圖3可知,隨著高壓均質壓力的增加,納米乳液的粒徑呈明顯降低的趨勢,當高壓均質壓力一定時,粒徑隨循環(huán)次數的增加呈減小的趨勢,這是因為高壓均質機均質一次具有一定的破碎顆粒概率,壓力在均質閥中產生的能量并不均勻,處于高能區(qū)的粒子就被破碎,而低能區(qū)的粒子不能被破碎,因此需要多次均質使得粒徑破碎更均勻[19]。但當液滴粒徑細到一定的程度時,繼續(xù)被破碎所需的能量與高壓均質機高壓產生的能量相等時,均質次數的增加對粒徑降低的效果并不顯著[20]。因此選定均質壓力110 MPa,均質次數3次進行后續(xù)的實驗。

圖3 不同高壓均質壓力和循環(huán)次數下納米乳液的平均粒徑

2.1.4 乳化劑濃度對蝦青素納米乳液的性能影響 乳化劑濃度對納米乳液粒徑和體系分散系數具有重要影響,如圖4(a),納米乳液粒徑隨卵磷脂濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,當卵磷脂濃度為1.0%(w/w)時,納米乳液粒徑達到最低。這主要是因為當乳化劑用量較少時,不能有效乳化體系中所含油脂,這不僅導致體系粒子粒徑變大,還導致油水界面膜強度變小,從而導致體系穩(wěn)定性降低。而當乳化劑用量過多時,乳化劑不僅能形成緊密的界面膜,過多的乳化劑還可能吸附在界面上,導致液滴粒徑變大[21]。對于乳液粒徑的PDI值,隨著乳化劑濃度的增加,粒徑的分布越不均一。由圖4(b)可知,乳液的蝦青素負載率在乳化劑濃度為0.5%～1.0%(w/w)時顯著(p<0.05)上升,在1.5%～2.5%(w/w)時略有下降趨勢。因此選定最佳乳化劑濃度為1.0%(w/w)。

圖4 不同乳化劑濃度下納米乳液的平均粒徑和分散系數(a)、蝦青素負載率(b)

2.1.5 油水比對蝦青素納米乳液的性能影響 由圖5(a)可知,油水比對納米乳液的粒徑和PDI值具有顯著的影響,液滴的粒徑隨著油水比的增加而顯著增大。這是由于當油含量增大時,定量的乳化劑為了能乳化更多的油脂,則需要增大所乳化的油滴體積,降低油滴與水相的接觸面積,從而導致體系粒徑的增大,因此油水比的增加不利于形成粒徑小且均一穩(wěn)定的納米乳液體系,而由圖5(b)可知,乳液的蝦青素負載率隨著油水比的增加而增加,油相的增大有利于負載更多的蝦青素,為獲得較高蝦青素負載率同時粒徑較低的乳液,選定最佳油水比例為1∶9。

圖5 不同油水比下納米乳液的平均粒徑和分散系數(a)、蝦青素負載率(b)

2.1.6 蝦青素添加量對蝦青素納米乳液的性能影響 由圖6可以看出,隨著蝦青素添加量的增加,納米乳液的粒徑和PDI值增大,蝦青素負載率整體變化幅度較小,均在80%以上,在添加量為0.7%(w/w)時達最大值,為92.91%。為保證在較高負載率下得到較小的粒徑范圍,在響應面實驗中選定蝦青素添加量范圍為0.1%～0.5%(w/w)。

圖6 不同蝦青素添加量下納米乳液的平均粒徑和分散系數(a)、蝦青素負載率(b)

2.2 BBD實驗結果及數據分析

2.2.1 BBD實驗設計方案結果及回歸模型方差分析 根據單因素實驗結果,由Design-Expert 8.0.6分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示,對所得數據進行回歸分析,回歸分析結果見表3、表4。

表2 響應面設計方案與實驗結果

表3 粒徑方差分析

以蝦青素納米乳液的粒徑和蝦青素負載率為響應值,利用Design-Expert 8.0.6分析軟件分別進行多元回歸擬合,其響應值與各因素之間的二次回歸方程如下:

Y1=246.21+7.15A+4.65B+1.57C+3.65AB-1.65AC-6.80BC+11.80A2+9.38B2-4.74C2

Y2=87.58+2.59A+4.60B+8.74C+0.99AB-0.34AC-2.50BC-3.64A2-1.86B2-5.80C2

由表3、表4的方差分析可得,回歸方程均差異極顯著(p<0.01),而失擬項均不顯著,根據方程的相關系數和校正系數,說明模型具有統(tǒng)計學意義,方程與實際情況擬合較好,能夠比較準確地反應出各因素以及各因素之間的相互影響關系,可用來對蝦青素納米乳液工藝過程進行初步分析和預測。在顯著性檢驗中,由表3可知,對于粒徑,一次項A、B的影響極顯著(p<0.01),表明乳化劑濃度和油水比對液滴粒徑有極顯著影響。各因素對納米乳液粒徑影響大小依次為乳化劑濃度>油水比>蝦青素添加量。二次項只有AC無顯著差異,說明油水比與乳化劑濃度、油水比與蝦青素添加量的交互作用對納米乳液粒徑有顯著影響。由表4可知,對于蝦青素負載率,乳化劑濃度、油水比和蝦青素添加量都對蝦青素的負載率有極顯著影響,且根據F值,其影響程度依次為蝦青素添加量>油水比>乳化劑濃度,同時油水比與乳化劑濃度、油水比與蝦青素添加量的交互作用對蝦青素的負載率有顯著影響。

表4 蝦青素負載率方差分析

2.2.2 各因素間對納米乳液粒徑及蝦青素負載率交互作用的響應面分析 根據二次回歸方程,對乳化劑濃度、油水比、蝦青素添加量3個影響因子的交互作用進行分析,分別得到各因素交互作用關系的響應面圖和等高線圖如圖7、圖8。

圖8 各因素對納米乳液蝦青素負載率影響的響應面圖

根據粒徑方差分析表3,乳化劑濃度和油水比、油水比和蝦青素添加量之間的交互作用顯著。圖7(a)所示為固定蝦青素添加量為零水平,乳化劑濃度與油水比對乳液粒徑的影響和兩者之間的交互作用。乳液粒徑隨乳化劑濃度和油水比的增加呈先下降后平緩上升的趨勢,且乳化劑濃度的下降幅度大于油水比,說明乳化劑濃度對乳液粒徑的影響較大。圖7(c)所示為固定乳化劑濃度為零水平,油水比和蝦青素添加量對乳液粒徑的影響和兩者之間的交互作用,可以看出油水比使粒徑下降的幅度較蝦青素添加量陡峭,說明油水比對乳液粒徑的影響較蝦青素添加量大。

圖7 各因素對納米乳液粒徑影響的響應面圖

根據蝦青素負載率方差分析表4,與對乳液粒徑影響的分析相同,乳化劑濃度和油水比、油水比和蝦青素添加量之間的交互作用顯著。圖8(c)所示為固定乳化劑濃度為零水平,油水比和蝦青素添加量對乳液蝦青素負載率的影響和兩者之間的交互作用。固定油水比不變時,蝦青素負載率隨蝦青素添加量增加先上升后達某一定值時趨于平緩,而固定蝦青素添加量不變時,蝦青素負載率隨油水比的增大而上升到趨于平緩。蝦青素添加量使蝦青素負載率增加的幅度較油水比稍陡峭,說明蝦青素添加量對乳液蝦青素負載率的影響較油水比稍大。圖8(a)所示為固定蝦青素添加量為零水平,乳化劑濃度與油水比對乳液蝦青素負載率的影響和兩者之間的交互作用。乳化劑濃度和油水比使乳液蝦青素負載率增加的幅度差異顯著,根據方差分析表,油水比對乳液蝦青素負載率的影響較乳化劑濃度大。

2.2.3 驗證實驗 為確定各因素的最佳取值,通過數學模型對蝦青素納米乳液的響應面分析,得到使乳液粒徑最小、蝦青素負載率最高的工藝參數:乳化劑濃度為0.965%(w/w),油水比為1∶8.450,蝦青素添加量為0.5%(w/w),此時模型預測納米乳液的粒徑為242.65 nm,蝦青素負載率為90.72%?？紤]到實際操作,將最佳工藝參數修正為乳化劑濃度為1%(w/w),油水比為1∶8.5,蝦青素添加量為0.5%(w/w),此條件下進行3次平行驗證實驗,得到平均粒徑為238.84 nm,蝦青素的負載率為90.41%,實際值與理論值相近,說明該響應面方法應用可靠。并且在4 ℃避光的貯存條件下,與溶于棕櫚油的蝦青素對照,一周后納米乳液蝦青素的保留率為85.34%,高于對照組的54.92%,說明蝦青素納米乳液能有效的緩解蝦青素的降解,提高其應用價值。

3 結論

根據單因素實驗,確定了制備蝦青素納米乳液的最佳乳化溫度為55 ℃,最佳乳化時間為45 min,高壓均質的最佳壓力及循環(huán)次數為110 MPa 3次,在此條件下采用響應面法對蝦青素納米乳液制備工藝條件中乳化劑濃度、油水比和蝦青素添加量三個因素進行了優(yōu)化,建立了乳液粒徑和蝦青素負載率的回歸模型,根據模型優(yōu)化的蝦青素納米乳液制備條件為乳化劑濃度為1%(w/w),油水比為1∶8.5,蝦青素添加質量分數為0.5%(w/w),按此條件下制備得到蝦青素納米乳液的粒徑為238.84 nm,蝦青素負載率可達到90.41%,與模型預測結果相近,進一步驗證了模型的可靠性。最優(yōu)制備條件下的蝦青素納米乳液與溶于棕櫚油的蝦青素對照組相對比,一周后納米乳液的蝦青素保留率高,穩(wěn)定性好。

[1]Zhang L,Wang H. Multiple mechanisms of anti-cancer effects exerted by astaxanthin[J]. Marine Drugs,2015,13(7):4310-4330.

[2]干昭波. 蝦青素的性質、生產及發(fā)展前景[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(3):38-40.

[3]張慧,徐公世. 蝦青素的研究和開發(fā)進展[J]. 中國食品添加劑,2005(C00):201-203.

[4]J Pu,JD Bankston,S Sathivel. Developing microencapsulated flaxseed oil containing shrimp(Litopenaeussetiferus)astaxanthin using a pilot scale spray dryer[J]. Biosystems Engineering,2011,108(2):121-132.

[5]朱明軍,宗敏華,吳振強,等. 蝦青素研究進展[J]. 食品工業(yè)科技,2000,31(2):81-83.

[6]Tachaprutinun A,Udomsup T,Luadthong C,et al.Preventing the thermal degradation of astaxanthin through nanoencapsulation[J]. International Journal of Pharmaceutics,2009,374:119-124.

[7]黃文哲，楊哪，謝正軍，等. 噴霧干燥制備蝦青素微膠囊的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31(07)：239-242.

[8]陳風平.低能化納米乳的制備及作為蝦青素運送體系的研究[D].青島:中國海洋大學,2014.

[9]Yu H L,Huang Q R. Improving the oral bioavailability of curcumin using novel organogel-based nanoemulsions[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(21):5373-5379.

[10]Tadros T,Izquierdo P,Esquena J,et al. Formation and stability of nano-emulsions[J]. Advances in Colloid and Interface Science,2004,108(10):303-318.

[11]Anarjan N,Mirhosseini H,Baharin BS,et al. Effect of processing conditions on physicochemical properties of astaxanthin nanodispersions[J]. Food Chemistry,2010,123(2):477-483.

[12]Troncoso E,Miguel Aguilera J,McClements D J. Fabrication,characterization and lipase digestibility of food-grade nanoemulsions[J]. Food Hydrocolloids,2012,27(2):355-363.

[13]Gong J,Huo M R,Zhou J P,et al. Synthesis,characterization,drug-loading capacity and safety of novel octyl modified serum albumin micelles[J]. International Journal of Pharmaceutics,2009,376(1-2):161-168.

[14]Mao L K,Xu D X,Yang J,et al. Effects of small and large molecule emulsifiers on the characteristics of beta-carotene nanoemulsions prepared by high pressure homogenization[J]. Food Technology and Biotechnology,2009,47(3):336-342.

[15]楊繼勤. 奇妙的天然乳化劑-卵磷脂[J]. 中國食品工業(yè),2000(12):32-33.

[16]杜有功. 蝦青素及其幾種含量測定方法簡介[C]//2015年浙江省醫(yī)學會臨床藥學分會、浙江省中西醫(yī)結合學會中藥分會學術會議論文集.浙江:浙江省科學技術學會,2015:5.

[17]Milton J. Rosen,Joy T.Kunjappu. 表面活性劑和界面現(xiàn)象[M]. 北京:化學工業(yè)出版社,2015.

[18]Liang R.,Xu S,Shoemaker CF,et al. Physical and antimicrobial properties of peppermint oil nanoemulsions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60:7548-7555.

[19]Yuan Y,Gao Y,Zhao J,et al. Characterization and stability evaluation ofβ-carotene nanoemulsions prepared by high pressure homogenization under various emulsifying conditions[J].Food Research International,2008,41:61-68.

[20]Kos Ei,S Petersen,L Helmdach,et al.Parameter selection of emulsification processes:Conditions for nano-and macroemulsions[J]. Chemical Engineering and Technology,2002,35:1604-1608.

[21]Y Yang,Me Leser,Aa Sher,et al. Formation and stability of emulsions using a natural small molecule surfactant:Quillaja saponin[J]. Food Hydrocolloids,2013,30(2):589-596.