樣品預(yù)處理方法對海岸典型沙生植物非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測定的影響

王松 杜建會 秦晶 張琪 邵佳怡

摘 要：量化植物非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（non-structural carbohydrate，NSC）含量對研究其生長和適應(yīng)策略具有重要意義，但其預(yù)處理方法多樣，導(dǎo)致不同研究結(jié)果之間的可比性較差。該研究以華南海岸典型沙生植物木麻黃、老鼠艻、海馬齒和厚藤為例，采用苯酚-濃硫酸法，分析是否去皮和過篩目數(shù)大小對其NSC及組分含量測定的影響。結(jié)果表明：（1）不同齡級木麻黃樣品去皮后提取的NSC、可溶性糖和淀粉含量均出現(xiàn)下降趨勢，與對照相比，幼齡林和中齡林樣品可溶性糖含量下降達(dá)到顯著水平（P<0.05），而淀粉含量差異不顯著，成齡林樣品NSC及其組分含量差異均不顯著。齡級越小，去皮預(yù)處理對樹木NSC及其組分提取影響越大，尤其以可溶性糖影響最為明顯，建議喬木處理時(shí)統(tǒng)一保留樹皮。（2）不同沙生植物枝（莖）樣品提取的NSC及其組分含量隨過篩目數(shù)增大總體呈增加趨勢，且木麻黃和老鼠艻枝（莖）過篩100目相對18目提取的NSC含量均達(dá)到顯著水平（P<0.05），而葉（同化枝）樣品除老鼠艻外均變化不顯著。（3）沙生植物器官機(jī)械組織含量越高，不同過篩目數(shù)提取的NSC及其組分含量差異越大，綜合考慮樣品獲取難度及NSC含量的測定精度，建議所有沙生植物枝葉樣品均過100目篩。

關(guān)鍵詞：沙生植物，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，去皮或未去皮，過篩目數(shù)，苯酚-濃硫酸法，平潭島

中圖分類號：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）10-1290-08

Abstract：Quantification of non-structural carbohydrate（NSC） contents of plants is of great significance to the exploration of their growth and adaptive strategies. However，various pretreating methods often lead to the poor comparability among different results. In this paper，four typical psammophytes on the coast of South China including Casuarina equisetifolia，Spinifex littoreus，Ipomoea pes-caprae and Sesuvium portulacastrum were studied，and the effects of pretreating methods on the determination of non-structural carbohydrate contents of plants by phenol-concentrated sulfuric acid method were analyzed，including the existence of the peel and mesh size. The results were as follows：（1） When peeled，NSC，soluble sugar and starch contents of the Casuarina equisetifolia samples all had a decreasing trend compared with the control group，especially significant in the soluble sugar contents of the young-aged forest and the middle-aged forest（P<0.05），but had no difference in both starch contents and all component contents in adult ones. The younger the age of samples，the greater the effect of peeling pretreatment on NSC and its component contents in trees，especially affected on soluble sugar，so we suggest to preserve tree bark when samples are processed.（2） The contents of NSC and its components of different psammophytess branches（stem） all raised with the increase of mesh size，and there were significant differences（P<0.05） in the Casuarina equisetifolias and Spinifex littoreuss branches（stem） samples which passed through the 100 and 18 mesh sieve. Except for Spinifex littoreus，all psammophytes leaves（assimilating branches） samples did not change much under different mush sizes and had no significant difference.（3） The higher the content of mechanical tissue in the samples，the more significant difference in the content of NSC and its components extracted by different mesh sizes. Considering the difficulty in obtaining samples and the accuracy of the determination of NSC content，we suggest that all branches and leaves of psammophytes should be processed by 100 mesh sieve. The conclusion of this study can guide the sample processing methods of related research in the coast of South China，standardize experimental methods and improve the comparability among different studies.

Key words：psammophyte，non-structural carbohydrate，peeled or not peeled，mesh size，phenol-sulfuric acid method，Pingtan Island

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（non-structural carbohydrate，NSC）是植物生長和代謝的重要物質(zhì)，主要包括可溶性糖和淀粉等（潘慶民等，2002）。其大小通?？梢苑从持参镎w的碳收支平衡關(guān)系以及對外界環(huán)境脅迫的適應(yīng)策略（Hartmann & Trumbore，2016）。因此，準(zhǔn)確量化植物NSC含量對研究其生長和適應(yīng)策略均具有重要的意義。測定植物器官NSC含量的方法很多，其中以苯酚-硫酸法（Dubois et al，1956）和蒽酮比色法（Raessler et al，2010）使用較為普遍，前者在測定植物器官NSC含量中具有操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，目前被許多學(xué)者廣泛采用（Liu et al，1973;Xi et al，2010）。該方法包括樣品預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)測定兩個(gè)部分。從已有的研究來看，不同學(xué)者的實(shí)驗(yàn)測定步驟大致相同，但樣品預(yù)處理方法則差異較大，尤其是在研磨和過篩的階段。在所篩選的97篇相關(guān)文獻(xiàn)中，研磨前有65%進(jìn)行了去皮處理（Rosas et al，2013），有35%沒有進(jìn)行去皮處理（歐陽明等，2014）。過篩時(shí)未說明目數(shù)的有46%（Li et al，2015），通過18目到40目的有23%（Yemm & Willis，1954），通過60目到80目的有12%（McCready et al，1950），通過100目及以上的有19%（Giannoccaro et al，2006）。

樹皮與樹芯NSC含量本身存在很大的差異（成方妍和王傳寬，2016），且過篩目數(shù)不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)所用樣品比表面積也不一樣，進(jìn)而影響到其與酒精提取液的接觸面積。在提取時(shí)間相同的情況下，同一樣品提取率可能存在很大差異，導(dǎo)致不同研究結(jié)果之間缺乏可比性（Quentin et al，2015）。本研究以華南海岸典型沙生植物為例，采用改進(jìn)的苯酚-濃硫酸法（Buysse & Merckx，1993），研究預(yù)處理過程中是否去皮和過篩目數(shù)大小對不同沙生植物NSC及其組分含量測定的影響，以期選擇合理的預(yù)處理方法，準(zhǔn)確量化不同沙生植物對于環(huán)境脅迫的響應(yīng)差異，加強(qiáng)不同研究結(jié)果之間的可比性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)壇南灣地處福建省平潭島東南側(cè)（地理位置為119°46′09″—119°46′21″E，25°26′36″—25°26′48″N），屬于南亞熱帶半濕潤海洋性季風(fēng)氣候，植被以常綠闊葉林為主。年平均氣溫19.5 ℃，年平均降水量1 151 mm，年平均蒸發(fā)量1 300 mm，年平均風(fēng)速6.9 m·s-1，多年平均大風(fēng)日數(shù)98.2 d（楊顯基等，2017a）。壇南灣是目前我國海岸沙地生態(tài)系統(tǒng)保存最為完整的地區(qū)，長達(dá)1.9 km的寬闊天然海岸線上，在季風(fēng)的影響下草叢沙堆發(fā)育顯著，近海發(fā)育階段草叢沙堆高約2 m，距海越遠(yuǎn)沙堆越高，至后沿穩(wěn)定階段與海岸木麻黃（Casuarina equisetifolia）防護(hù)林交界處，其高度為4 m左右。各沙堆連片且呈帶狀分布，形成寬達(dá)300 m的典型草叢沙堆帶。沙堆表面植物以老鼠艻（Spinifex littoreus）為主要優(yōu)勢種，而海灘前緣則主要以厚藤（Ipomoea pes-caprae）和海馬齒（ Sesuvium portulacastrum ） 等鹽生植物為主。

1.2 研究方法

1.2.1 野外采樣 采樣時(shí)間為2016年12月，考慮到距海遠(yuǎn)近不同，沙生植物呈現(xiàn)為明顯的帶狀分布。沿著垂直于海岸線方向設(shè)置典型樣帶，從防護(hù)林到潮間帶依次選擇木麻黃、老鼠艻、厚藤和海馬齒作為研究對象。具體采樣方法如下：（1）對采樣的木麻黃林地進(jìn)行整體考察，根據(jù)其種植年限將木麻黃劃分為幼齡林、中齡林和成齡林，其中幼齡林樹齡為5 a，中齡林樹齡為15 a，成齡林樹齡為30 a，每個(gè)齡級各選擇3株具有代表性的優(yōu)勢木。用高枝剪在樹冠上、中、下三個(gè)冠層的東、西、南、北四個(gè)方向各隨機(jī)剪下直徑 5 mm 左右、長勢良好的樹枝。（2）根據(jù)老鼠艻沙堆的形態(tài)、植被和土壤性質(zhì)等差異將其劃分為雛形、發(fā)育和穩(wěn)定3個(gè)階段（楊顯基等，2017b），在不同演化階段沙堆迎風(fēng)坡表面選擇長勢較為良好的老鼠艻地上部分植株，用剪刀整株剪下。（3）在海灘前緣采集樣地內(nèi)長勢良好的厚藤和海馬齒地上部分莖葉，所有樣品均各取3份，首先就地編號后裝入自封袋中，放入0～4 ℃的冷藏箱，快速帶回實(shí)驗(yàn)室;然后采用人工將枝（莖）葉分離，擦凈樣品表面污物，采用微波爐進(jìn)行高溫（600 W）90 s的殺青處理;最后將樣品封裝貼好標(biāo)簽，用恒溫烘箱在 65 ℃下烘干48 h至恒重，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 樣品預(yù)處理 去皮預(yù)處理：將不同齡級木麻黃枝樣品隨機(jī)分成兩份，部分采用人工去皮，將樹皮和樹芯分離，其余作為對照。過篩預(yù)處理：將去皮后的木麻黃成齡林、不同演化階段沙堆表面老鼠艻、厚藤和海馬齒樣品按照枝（莖）葉分離。所有樣品烘干后剪碎混勻，放入咖啡機(jī)（NMD226電動(dòng)磨豆機(jī)）或研缽中研磨，之后均通過從上至下（篩孔尺寸分別為18目、65目、100目）的3個(gè)網(wǎng)篩。其中，通過18目不通過65目記為18目樣品、通過65目不通過100目記為65目樣品、通過100目記為100目樣品。去皮預(yù)處理只選擇100目樣品，過篩預(yù)處理保留三個(gè)不同目數(shù)的樣品。每個(gè)樣品采用分析天平（精度為0.000 1 g）取20 mg放入10 mL已編號的離心管中以備測定。

1.2.2.2 樣品測定 先在樣品中加入1 mL 80%酒精并抽提過夜，然后在離心機(jī)中以3 500 r·min-1離心7 min，吸取上清液至離心管中。殘?jiān)偌尤刖凭?，同樣的操作離心后，將上清液一并倒入10 mL離心管，定容至5 mL;取剩余殘?jiān)?，加? mL 8%鹽酸于105 ℃沸水中煮2 h，待冷卻后加入1 mL酒精后以3 500 r·min-1離心7 min，吸取上清液至離心管中。殘?jiān)偌尤刖凭?，同樣的操作離心后，將上清液一并倒入10 mL離心管，定容至5 mL。吸取1 mL樣品液于試管中，按順序分別加入0.5 mL苯酚、2.5 mL濃硫酸溶液，混勻顯色30 min后，在485 nm波長下采用紫外分光光度計(jì)（Spectrumlab752s型）進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的吸光度值。

1.2.2.3 結(jié)果計(jì)算 可溶性糖含量=C×VTV1×W×100%。

式中，C為吸光度值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后的糖含量（mg），V T為提取液體積（mL），V1為吸取樣品液體積（mL），W為選取的樣品干重（mg）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均在WPS Office 2016和SPSS 20.0 軟件系統(tǒng)下完成，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)研究是否去皮對不同齡級木麻黃枝樣品提取的NSC及其組分含量的影響，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）研究不同過篩目數(shù)對沙生植物樣品提取的NSC及其組分含量的影響（P=0.05），論文圖表用Origin 9.0軟件繪制完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 去皮處理對不同齡級木麻黃枝條NSC及其組分含量提取的影響

去皮處理后，不同齡級木麻黃枝條提取的可溶性糖、淀粉和NSC含量均低于未去皮處理（圖1）。從不同齡級來看，去皮后木麻黃幼齡林和中齡林枝條提取的可溶性糖含量下降幅度最大，與對照相比分別下降51.71%和86.76%，且達(dá)到了顯著程度（P<0.05）（圖1：A，B），成齡林雖有下降，但差異不顯著（圖1：C）;去皮后木麻黃提取的淀粉含量下降幅度較小，不同齡級差異均不顯著;去皮后木麻黃幼齡林提取的NSC含量下降34.42%，與對照相比差異達(dá)到顯著程度（P<0.05），而其它兩個(gè)齡級差異不顯著。齡級越小，去皮預(yù)處理對木麻黃提取的NSC及其組分含量影響越大，尤其以可溶性糖含量影響最為明顯。

2.2 不同過篩目數(shù)對沙生植物枝（莖）與葉NSC及其組分含量提取的影響

2.2.1 不同過篩目數(shù)對沙生植物枝（莖）NSC及其組分含量提取的影響 隨著過篩目數(shù)增加，不同沙生植物枝（莖）提取的NSC及其組分含量總體呈增加趨勢（圖2）。與18目相比，過篩100目后雛形、發(fā)育和穩(wěn)定階段沙堆表面老鼠艻莖提取的NSC含量分別增加了53.8%、45.2%、36.1%（圖2：A，B，C），成齡林木麻黃枝提取的NSC含量增加幅度最大，達(dá)到了114.2%（圖2：D），且均達(dá)到顯著水平（P<0.05）;與18目相比，過篩100目后發(fā)育和穩(wěn)定階段沙堆表面老鼠艻、成齡林木麻黃枝（莖）提取的可溶性糖含量分別增加59.4%、56.5%、284.8%，雛形階段沙堆表面老鼠艻莖提取的淀粉含量增加53.1%，且均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。其它沙生植物枝（莖）樣品隨著過篩目數(shù)增加提取的可溶性糖、淀粉和NSC含量雖有增加，但變化均不顯著（圖2：E，F(xiàn)）。

2.2.2 不同過篩目數(shù)對沙生植物葉片NSC及其組分含量提取的影響 過篩目數(shù)對于不同沙生植物葉片提取的NSC及其組分含量總體影響不大（圖3）。隨著過篩目數(shù)增加，不同演化階段沙堆表面老鼠艻葉片提取的NSC及其組分含量均呈現(xiàn)輕微的升高趨勢，與18目相比，過篩100目后雛形階段沙堆表面老鼠艻葉片提取的淀粉含量升高了20.2%，發(fā)育階段沙堆表面老鼠艻葉片提取的可溶性糖含量升高了78.9%，兩者均達(dá)到了顯著程度（P<0.05），穩(wěn)定階段沙堆表面老鼠艻葉片提取的NSC及其組分含量雖有輕微的升高趨勢，但變化均不顯著（圖3：A，B，C）。而木麻黃成齡林、厚藤和海馬齒葉片（同化枝）提取的NSC及其組分含量隨著過篩目數(shù)的增加均無明顯的變化趨勢（圖3：D，E，F(xiàn)）。

3 討論

去皮處理后，不同齡級木麻黃枝條提取的NSC及其組分含量均低于未去皮處理，尤其以可溶性糖含量影響最為明顯。NSC在樹干中的空間分布仍然存在著很多爭議（Hartmann & Trumbore，2016），但大部分研究認(rèn)為，樹皮中的NSC含量均顯著高于木質(zhì)部。成方妍和王傳寬（2016）對黑龍江省帽兒山三個(gè)樹種NSC研究表明，樹皮NSC平均儲量分別是邊材和心材儲量的3倍和5倍。本研究樣品采集時(shí)間為12月初，此時(shí)植物遭受的低溫、干旱和鹽分脅迫最為嚴(yán)重，樹皮中較高的可溶性糖含量有助于其維持滲透壓，從而保證水力傳輸?shù)姆€(wěn)定（brien et al，2014），導(dǎo)致去皮后提取的可溶性糖含量出現(xiàn)了顯著下降。與成齡林相比，幼齡林與中齡林根系均不發(fā)達(dá)，樹干儲存的NSC總量也相對較少，對外界環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力相對較弱，而樹皮中較高的可溶性糖含量有助于其維持一定的莖葉水勢，保證碳水化合物的持續(xù)合成，進(jìn)而有利于其穩(wěn)定生長（Nardini et al，2016）。因此，去皮后幼齡林與中齡林提取的可溶性糖含量相對于成齡林下降更為顯著。

隨著過篩目數(shù)增加，不同沙生植物枝（莖）樣品提取的可溶性糖、淀粉和NSC含量總體呈增加趨勢，這與王文杰等（2009）的研究結(jié)果較為一致。同樣的提取時(shí)間內(nèi)，過篩目數(shù)越大，樣品顆粒越小，比表面積越大，待測組分越容易被提?。∕osharraf & Nystrm，1995）。本研究采用酒精提取不同沙生植物枝（莖）樣品可溶性糖及淀粉，粒度不同則在相同時(shí)間下提取的可溶性糖含量也不同（岑沛霖等，1993）。因此，樣品過篩目數(shù)越大，其提取的NSC及其組分含量越大。此外，不同沙生植物枝（莖）樣品解剖結(jié)構(gòu)不同，其機(jī)械組織含量也有很大差異，本身也會阻礙相關(guān)組分的溶出，進(jìn)而影響到提取的NSC及其組分含量（沈廣爽等，2014）。厚藤和海馬齒莖部提取的NSC及其組分含量隨過篩目數(shù)的增加差異不顯著。這主要在于厚藤屬于草質(zhì)藤本，海馬齒屬于肉質(zhì)草本，二者莖部木質(zhì)化程度均較低，機(jī)械組織含量少，使得莖部的強(qiáng)度與韌性相對偏低（Wilson，1965）;烘干后相對于木麻黃與老鼠艻更易磨碎，導(dǎo)致莖樣品過篩不同目數(shù)后粒度差異相對較小，同樣時(shí)間下提取的NSC及其組分含量差異不顯著。而成齡林木麻黃及不同演化階段沙堆表面老鼠艻枝（莖）樣品提取的NSC及其組分含量均隨著過篩目數(shù)增加呈增大趨勢，且多個(gè)組分差異顯著。這主要在于木麻黃屬于多年生常綠喬木，隨著樹木的生長，其枝條木質(zhì)化程度增加，而老鼠艻屬于多年生小灌木狀草本，莖部粗壯，具有豐富的厚壁細(xì)胞和纖維，機(jī)械組織發(fā)達(dá)，保護(hù)地上部分在刮風(fēng)期間不被吹折（楊顯基等，2017a）。但是，也會導(dǎo)致樣品烘干后極難磨碎，過篩不同目數(shù)后樣品粒度異質(zhì)性較大，在同樣提取時(shí)間下NSC及其組分含量差異相對顯著。

隨著過篩目數(shù)增加，除老鼠艻葉片提取的部分NSC組分有顯著增加外，厚藤、海馬齒和木麻黃葉片提取的NSC及其組分含量均變化不大。這主要在于老鼠艻屬于旱生植物，革質(zhì)葉，質(zhì)堅(jiān)而厚，呈刺狀，發(fā)達(dá)的機(jī)械組織有助于其抵御海岸地區(qū)風(fēng)割沙埋，也可以減少人畜踩踏（宋玉霞等，1997;沈廣爽等，2014）。受其葉片強(qiáng)度及韌性影響，烘干后難以研磨，導(dǎo)致過篩不同目數(shù)后，葉片提取的部分NSC組分差異較大。而厚藤和海馬齒均為鹽生植物，其表皮細(xì)胞角質(zhì)膜較薄，維管組織和機(jī)械組織均不發(fā)達(dá)，烘干后極易磨碎（李瑞梅等，2010;歐陽蒲月等，2011）;木麻黃的葉子嚴(yán)重退化成同化枝，葉叢由具規(guī)則節(jié)間的節(jié)相連，烘干后同化枝在咖啡機(jī)刀片的打磨下極易沿著規(guī)則節(jié)間斷裂，使得研磨后的樣品粒度均勻性較高（安平和薛東育，1990）。因此，過篩不同目數(shù)后其提取的NSC及其組分含量差異均較小。

4 結(jié)論

準(zhǔn)確量化植物NSC含量對于理解不同沙生植物的適應(yīng)策略具有重要的意義。本研究以華南海岸4種典型沙生植物為例，研究樣品預(yù)處理方法對其提取的NSC及其組分含量的影響。結(jié)果表明，不同樣品預(yù)處理方法對華南海岸典型沙生植物NSC及其組分含量提取影響很大。去皮處理會降低木麻黃樣品提取的NSC及其組分含量，齡級越小，影響越大，建議統(tǒng)一保留樹皮;隨著過篩目數(shù)增加，沙生植物枝（莖）樣品提取的NSC及其組分含量總體呈增大趨勢，而葉樣品提取的NSC及其組分含量差異不大。樣品機(jī)械組織含量越高，粉碎后其顆粒的不均勻性越大，過篩目數(shù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著。加上本研究樣品用量僅為20 mg，與過篩18目的樣品相比，樣品的不均勻性導(dǎo)致過篩100目后提取的NSC及其組分含量差異進(jìn)一步放大。但過篩目數(shù)越高，樣品獲取越困難，建議所有沙生植物枝葉樣品均采用100目篩進(jìn)行處理，以加強(qiáng)不同研究結(jié)果之間的可比性。