羅漢果花氣味物質量化分析方法研究

方振名 胡興華 劉長秋 黃仕訓

摘 要：羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科著名的藥食兩用植物，廣泛種植于廣西桂林地區(qū)，其開花后傳粉不良現象迫切需要研究解決。為了探討羅漢果花朵氣味物質與傳粉者訪花頻率的關系以及查明傳粉不良產生的原因，該文選擇羅漢果雄花為材料，研究了羅漢果花朵氣味物質的量化分析方法。實驗采用動態(tài)頂空吸附法收集新鮮花朵的氣味物質，經過洗脫、洗脫液吹氮和GC-MS分析等步驟，先后完成了花朵氣味物質的收集、濃縮、分離和鑒定，最后以峰面積歸一化法計算各化學組分的相對含量。結果表明：從供試花朵中檢測到揮發(fā)性組分（包括萜烯類物質）5種，以及芳香烴類、烷烴類、酯類物質各1種，其中萜烯類物質的相對含量達71.07%，是供試花朵最主要的揮發(fā)性化合物。該結果高度符合葫蘆科植物花朵氣味的化學組分特征，并具有良好的實驗重復性，表明該實驗體系是收集和鑒定羅漢果花朵氣味組分的理想方法，為后續(xù)開展羅漢果花氣味物質研究奠定了重要基礎。同時通過與葫蘆科多種植物比較，發(fā)現羅漢果的花朵氣味物質可能存在雌雄二型性。

關鍵詞：羅漢果， 花氣味物質， 動態(tài)頂空吸附， GC-MS分析， 葫蘆科

中圖分類號：Q94-3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）11-1505-07

Abstract：The dioecious Siraitia grosvenorii is a famous edible and medicinal plant in Cucurbitaceae， and both the food parts and medicinal parts of this plant are their fruits. Because of the important economic value， it has been widely planted for a long history in Guilin， Guangxi， China. However， the problem of pollen limitation in S. grosvenorii is urgently needed to be solved. In order to study the relationship between flower scent substance and flower-visiting frequency， and to find out the reasons for pollen limitation， we collected the scent substance of fresh male flowers of S. grosvenorii by dynamic headspace adsorption technique. After elution of the absorption column， the eluent was concentrated by nitrogen blowing method. Subsequently， the concentrated eluent was analyzed by gas chromatography coupled with mass spectrometry （GC-MS）. In this process， the collection， concentration， separation and identification of the scent substance in male flowers of S. grosvenorii were conducted. Finally， the relative content of each substance was calculated by the peak area normalization method. Among the scent substance of S. grosvenorii male flowers， we totally found five terpenes， one aromatic hydrocarbons， one alkanes and one esters， in which the terpenes occupy a relative content of 71.07%， ranking the highest content. This result showed a high agreement with that of the previous studies on composition of floral scent substance in Cucurbitaceae plants， and had good experimental reapeatability. Further analysis showed that the experiment system in this study is a solid and efficient method for the quantitative analysis of S. grosvenorii flower， laying the important foundation for the floral scent research towards the pollen limitation in this plant.

Key words：Siraitia grosvenorii， flower scent substance， dynamic headspace adsorption （DHSA）， GC-MS analysis， Cucurbitaceae

在植物引誘動物訪花和傳粉的性狀中，引起傳粉者視覺和嗅覺識別反應的性狀有著非常重要的作用（Delle-Vedove et al， 2011）。但是，已有研究主要關注引起視覺反應的花部性狀，如花的顏色（Peter & Johnson， 2008; Sara et al， 2016）、花冠大小及形狀（Mason & Anne， 2012）等，并揭示了一些重要的傳粉與繁育機制（Brodmann et al，2009;Shuttleworth et al，2010），但對引起嗅覺識別反應的性狀卻研究較少（Raguso，2008）。隨著氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用等高靈敏度分析方法的出現，花朵揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds， VOCs）痕量組分的檢測能力發(fā)生了質的飛躍，花氣味物質的量化研究因此得到深入開展（Delle-Vedove et al， 2017）。目前，已有一千多種植物的花朵氣味物質得到檢測（Knudsen et al，2006），其中已有部分物質被證明對傳粉者有引導功能（Schlumpberger & Raguso，2008;Shuttleworth & Johnson，2009）。

GC-MS的出現解決了精確檢測氣味物質化學組分的問題，但從花朵收集氣味物質的方法卻尚需發(fā)展和完善。傳統(tǒng)上，收集花朵氣味物質常使用溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法和超臨界流體提取法等，這些方法需要將花朵干燥和粉碎，再以溶劑浸泡分離，或者在高溫條件下收集（丁嘉文等，2015;趙彥貴和張慧娟，2018）。由于這些方法破壞了花朵的自然狀態(tài)，鑒定出的揮發(fā)性物質與花朵在自然條件下釋放的氣味物質差別顯著，所以這些方法通常不適用于傳粉生物學研究。后來提出的固相微萃取法可在保持花朵處于自然的狀態(tài)下進行氣味物質收集，但其缺點是只能在實驗室條件下操作，不能在野外進行花的氣味物質收集（宋述芹等，2017）。為解決上述各種方法的不足，Jennings et al（1972）提出動態(tài)頂空吸附法，以解決野外收集新鮮花朵氣味物質的問題。該方法的收集原理是在半封閉容器中放入新鮮花朵，之后抽動密閉氣路中的空氣，從而把花朵釋放的氣味成分帶出容器到達吸附柱，并被吸附劑吸附而分離出來。使用該方法收集花朵氣味物質后，吸附柱可在野外環(huán)境下長時間存放，待野外實驗結束再移至實驗室洗脫析出。后來中國學者李慶良等（2012）對該方法進行了完善，使之更便于操作和適用于野外實驗。

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科多年生藤本植物，果實藥食兩用，是廣西著名特產，在廣西的農業(yè)經濟中占有重要比重（李典鵬和張厚瑞，2000）。不過，羅漢果開花后自然傳粉嚴重不良，需要人工授粉才能坐果，導致種植成本居高不下，成為種植業(yè)發(fā)展的重要限制因子。鑒于花朵氣味物質對吸引傳粉動物具有重要作用，羅漢果傳粉不良可能與花朵氣味物質異常有關。因此，收集羅漢果花朵氣味物質，并對其化學組分進行精確檢測，通過與葫蘆科近緣植物對比分析，有助于查明羅漢果傳粉不良的原因，對促進羅漢果種植業(yè)發(fā)展意義重大?？紤]不同氣味收集方法的優(yōu)缺點，動態(tài)頂空吸附法更適于羅漢果新鮮花朵氣味物質收集和分析，但該方法尚未在羅漢果中得到成功應用。本研究嘗試探索采用動態(tài)頂空吸附法收集羅漢果花的氣味物質，并以氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用技術分析其組分及含量，以摸索可精確分析羅漢果花氣味物質的技術體系，為深入開展羅漢果花氣味物質研究奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

為檢驗實驗體系產出結果的準確性和穩(wěn)定性，以一個植株的花朵為材料設置重復實驗。在自然條件下，一個植株同期開放的花朵通常具有同一性的氣味物質，有利于檢驗實驗體系在重復實驗中的穩(wěn)定性。羅漢果為雌雄異株植物，鑒于雄性單株產花量遠大于雌性單株，可取足夠的花朵進行重復實驗，因此以雄花為材料開展分析。2016年9月下旬，從廣西植物研究所實驗苗圃里1株處于盛花期的羅漢果雄株以潔凈剪刀快速剪花30朵，以10朵為1組，隨機分成三組進行實驗。

1.2 儀器和試劑

儀器：HP7890A（GC）-5975C（MS）型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），聚氟乙烯采集袋[Tedlar（PVF），8 L，美國Dupont公司]，小流量氣體采樣泵（Libra-4，北京賽福萊博科技有限公司），活性炭管（外徑6 mm，長75 mm），吸附柱（100 mg/50 mg， 60目/80目，外徑6 mm，長75 mm，美國Sigma-Aldrich公司），無味特氟隆管（PTFE，美國Dupont公司），棕色進樣瓶（2 mL，美國Agilent公司），洗耳球，針頭式過濾器，特制圓柱體玻璃筒（高15 cm，內徑5 cm，天津市領航實驗設備有限公司）。試劑：吸附劑（PoraPak Q80-100，愛爾蘭Waters公司），正己烷（色譜純級，美國Fisher公司）。

1.3 氣味物質收集系統(tǒng)

采用動態(tài)頂空吸附法（黃代紅等，2015）收集羅漢果花氣味物質。采集的羅漢果新鮮花朵迅速放入特制圓柱體玻璃筒內，在玻璃筒外套聚氟乙烯采集袋，以卡條密封采集袋兩端。以特氟隆管分別連接采樣袋與活性炭管、吸附柱以及氣體采樣泵（圖1）。啟動氣體采樣泵，空氣經活性炭管凈化后進入采樣袋，經過放置羅漢果花朵的玻璃筒后進入填充了PoraPak Q吸附劑的吸附柱，此時花朵氣味物質被吸附劑吸附（圖1）。氣體采樣泵的空氣流速400 mL·min-1，收集時間為4 h。以3套相同的系統(tǒng)分別同時收集三組花的氣味物質。

收集完成后，取潔凈棕色進樣瓶3個，分別加入正己烷500 μL，把3條吸附柱分別垂直插入1個進樣瓶，保持正己烷液面剛好沒過吸附柱下端開口，在吸附柱上端開口插入洗耳球，抽打正己烷反復洗脫吸附管內的吸附劑30次，得到三份洗脫液，再以氮氣吹洗洗脫液，使之濃縮至約50 μL，進入下一步的GC-MS分析。

1.4 氣相色譜分析

在黃代紅等（2015）方法基礎上進行適當優(yōu)化和改進。色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm， Agilent， 美國），程序升溫：40 ℃保持5 min，之后以3 ℃·min-1升溫至100 ℃，再以5℃·min-1升至200 ℃，保持5 min;進樣量2 μL，進樣分流比為41;進樣口溫度250 ℃;載氣為高純He，流速1.0 mL·min-1。

1.5 質譜分析

電離方式EI，質量掃描范圍m/z 35-450;電子能量70 eV;接口溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃。氣相色譜檢出成分在質譜儀的標準譜庫（NIST 05）進行檢索，并運用峰面積歸一化法計算氣味各組分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 羅漢果花氣味物質氣相分析結果

吸附柱的洗脫液經過GC-MS分析，獲得總離子流程圖，三組花的氣味物質總離子流程圖非常相似。在離子流程圖上可見組分峰13個，分別處于第7 min至第41 min之間（圖2，僅示重復1的總離子流程圖）。經檢索鑒別，其中5個為雜質峰，8個為揮發(fā)性有機化合物峰。

2.2 羅漢果花氣味物質成分

從三份洗脫液中鑒定出的氣味物質組分完全相同，均由8種物質組成，其中萜烯類5種，分別為左旋-α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、β-月桂烯、檸檬烯;烷烴類1種，為乙酸， 雙（三甲基硅基氧基氧膦基），三甲基酯;芳香烴類1種，為1，3-二乙基苯;酯類1種，為2，6-雙（三甲基甲硅烷氧基）苯甲酸三甲基甲硅烷基酯。三份洗脫液不僅化學組分完全相同，而且各組分的相對含量也非常接近。例如，三份洗脫液均是萜烯類組分最多，相對含量累計達71.07%，其中的檸檬烯作為相對含量最高的單一組分，占比達37.58%。其余組分中，芳香烴類的相對含量為4.25%，烷烴類的為1.78%，酯類的為0.52%（表1）。

3 討論

采用動態(tài)頂空吸附的方法收集植物花的氣味物質，再以GC-MS法精確分析其組分，該方法除了分析精度高，以及可量化分析之外，還因收集系統(tǒng)輕量便攜，吸附柱可長時間保存等優(yōu)點，特別適于在野外收集植物的花朵氣味物質，在植物傳粉和進化研究中應用前景廣闊。如國內學者黃代紅等（2016）用該方法收集鑒定了小果葉下珠（Phyllanthus microcarpus）雌花和雄花氣味化學成分，發(fā)現花氣味物質存在兩性異型性，推測是植物為適應傳粉者高度特異的傳粉行為的結果。而張振國等（2016）采用該方法收集了三室算盤子（Epicephala ancylopa）雌雄花的氣味物質，鑒定出24種揮發(fā)物，其中單萜類和倍半萜類為主要物質，推測是吸引傳粉者彎頭細蛾傳粉的主要氣味成分。

本研究根據羅漢果花朵特征，對動態(tài)頂空吸附結合GC-MS分析的方法進行了適當優(yōu)化，形成羅漢果花氣味物質量化分析的實驗體系。實驗檢測到萜烯、烷烴、芳香烴和酯類的8種揮發(fā)性組分。此前研究表明，這些揮發(fā)性組分是植物體次生代謝合成的易揮發(fā)小分子化合物，是植物花器官最主要的氣味物質（Dudareva et al，2013;蔣冬月和李永紅，2011），本實驗較完整地檢測到上述組分，說明實驗系統(tǒng)成功收集到了花朵的氣味物質。通過與葫蘆科近緣植物的花朵進行氣味物質比較，可以確定這些揮發(fā)性組分來源于羅漢果的花朵。在Fernando & Grün （2001）所檢測的絲瓜（Luffa acutangula）和苦瓜（Momordica charantia） 的花朵氣味中，最主要的組分分別有萜烯、芳香烴和酯類，與本實驗檢測到的揮發(fā)性組分高度相似。特別在萜烯類物質中，絲瓜和苦瓜的花朵共有的幾種物質，如α-蒎烯、β-蒎烯和β-月桂烯等，都出現在我們檢測到的化學組分中。南瓜花的氣味物質提供了更好的參照，南瓜（Cucurbita moschata） 雄花的氣味物質主要由萜烯、烷烴、芳香烴和酯類物質組成，其中萜烯類相對含量最大，約為49.59%（李昌勤等，2012），這與本實驗的結果幾乎完全相同，僅有的差異，是本實驗中萜烯類的相對含量更高，達到71.07%。當然，也有葫蘆科植物的花朵氣味物質與我們的檢測結果不同，如栝樓（Trichosanthes kirilowii），其花朵氣味物質僅由苯甲醛、苯乙醛和芳香醇組成 （Miyake et al， 1998），與我們檢測羅漢果的結果差異明顯，也與苦瓜、絲瓜和南瓜的相去甚遠。

總體來看，本研究結果與羅漢果多種近緣植物的花朵氣味物質高度相似，可以判斷這些揮發(fā)性組分是羅漢果雄花的氣味物質。同時，由于實驗設置的3個重復均獲得高度相似的化學組分，表明實驗體系在重復實驗中穩(wěn)定性良好。綜上，本研究為量化分析羅漢果花朵氣味物質而設計的實驗體系可行有效，為系統(tǒng)研究羅漢果花朵的氣味物質奠定重要基礎。本研究使用羅漢果雄花為材料進行分析，發(fā)現該雄花的氣味物質與絲瓜、苦瓜和南瓜的高度相似，考慮后三種植物并未存在傳粉不良現象，則羅漢果的傳粉不良現象暗示該植物在花朵氣味物質上可能存在雌雄二型，導致雌、雄花吸引傳粉者的能力失去匹配，這有待后續(xù)實驗加以探究和驗證。