張俊平 王英強(qiáng)

摘 要：? qRT-PCR技術(shù)具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，被廣泛用于基因表達(dá)分析。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性對(duì)于準(zhǔn)確分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常重要。該研究以黃花大苞姜（Caulokaempferia coenobialis）花粉母細(xì)胞時(shí)期（PMC）、四分體時(shí)期（TET）、成熟花粉時(shí)期（MP）的花藥組織為材料，基于3個(gè)階段花藥轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及常用傳統(tǒng)內(nèi)參基因，篩選出Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）、Malate dehydrogenase （MDH）、α-tubulin3 （TUA3）、β-tubulin7 （TUB7）和Actin6 （ACT6）作為候選內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR分析;并運(yùn)用BestKeeper、geNorm和Normfinder軟件綜合分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明：MDH和TUB7的表達(dá)最穩(wěn)定，ACT6的穩(wěn)定性最差;分別以MDH和TUB7作為內(nèi)參，分析GBE1在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達(dá)模式，并與該基因在花藥轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)模式做相關(guān)系數(shù)分析，3種表達(dá)模式結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了MDH和TUB7的表達(dá)穩(wěn)定性。這說(shuō)明MDH和TUB7適合作為qRT-PCR分析黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)模式的內(nèi)參基因。該研究結(jié)果為黃花大苞姜花藥發(fā)育分子機(jī)制相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，也為姜科花藥發(fā)育相關(guān)內(nèi)參基因的選擇提供了參考。

關(guān)鍵詞： 黃花大苞姜， 花藥， 內(nèi)參基因， qRT-PCR， BestKeeper， geNorm， Normfinder

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2018）01-0076-08

Selection of reference genes for quantitative real-time PCR during anther development of Caulokaempferia coenobialis （Zingiberaceae）

ZHANG Junping1， WANG Yingqiang1， 2*

（ 1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development， College of Life Sciences， South China Normal University， Guangzhou 510631， China; 2. Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring College of Life Sciences， South China Normal University， Guangzhou 510631， China ）

Abstract：? Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） has been widely used in gene expression analysis with quantitative accuracy， high sensitivity and good repeat ability. The stability of the reference genes is very important to accurate analysis of the target genes expression. Anther tissues from pollen mother cells stage （PMC）， tetrad stage （TET） and mature pollen stage （MP） of Caulokaempferia coenobialis （Zingiberaceae） were used to select reference genes. According to the developing anther transcriptome expression profile data and traditional reference genes reported， Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）， Malate dehydrogenase （MDH）， alpha tubulin3 （TUA3）， beta tubulin7 （TUB7） and Actin6 （ACT6） were selected as candidate reference genes for qRT-PCR analysis. The expression stability of five candidate reference genes during the anther development was comprehensive analysis by BestKeeper， geNorm and Normfinder software. The results showed that the expression of MDH and TUB7 were the most stable， and the ACT6 was the worst. The expression patterns of GBE1 during anther development was obtained based on MDH and TUB7 as reference gene respectively. And the expression stability of MDH and TUB7 was further verified by correlation coefficient analysis （Pearson） with the anther transcriptome expression profile data. The results showed that MDH and TUB7 could serve as qRT-PCR reference gene to analyse the gene expression pattern related to anther developing in C. coenobialis. The study would provide research fundamental data for molecular mechanism research of anther development in C. coenobialis， and reference for the selection of reference genes in other Zingiberaceae species during anther development.

Key words： Caulokaempferia coenobialis， anther， reference gene， quantitative realtime PCR（qRT-PCR）， BestKeeper， geNorm， Normfinder

黃花大苞姜（Caulokaempferia coenobialis）是中國(guó)特有的姜科大苞姜屬植物，具有獨(dú)特的花粉滑動(dòng)自花授粉機(jī)制（Wang et al， 2004， 2005），花粉呈粘液狀，與擬南芥、水稻的干性花粉顯著不同。因此，其花藥發(fā)育相關(guān)的研究，對(duì)于了解和補(bǔ)充精密的花藥發(fā)育分子機(jī)制具有重要意義。但目前關(guān)于黃花大苞姜花藥發(fā)育的相關(guān)研究卻尚還未見(jiàn)有報(bào)道。? qRT-PCR技術(shù)具有定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高及高通量等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基因表達(dá)分析（Nolan et al， 2006; Huggett et al， 2005）。但由于RNA提取質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率等因素?zé)o法完全統(tǒng)一，目的基因表達(dá)準(zhǔn)確性會(huì)受到一定影響，因此不能真實(shí)反映基因的表達(dá)情況，需要內(nèi)參基因來(lái)矯正和標(biāo)準(zhǔn)化，而一個(gè)好的內(nèi)參可以消除這些影響（Vanguilder et al， 2008; Derveaux et al， 2010）。因此，篩選特定條件下最適內(nèi)參基因?qū)τ跍?zhǔn)確分析目的基因的表達(dá)情況至關(guān)重要。

本研究基于黃花大苞姜花粉母細(xì)胞時(shí)期（Pollen mother cell stage，PMC）、四分體時(shí)期（Tetrad stage， TET）和成熟花粉時(shí)期（Mature pollen stage， MP）的花藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的植物qRT-PCR內(nèi)參基因（胡瑞波等，2009;牙庫(kù)甫江等，2011）。篩選出了表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的5個(gè)基因Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Malate dehydrogenase（MDH）、α-tubulin3（TUA3）、β-tubulin7（TUB7）和Actin6（ACT6）作為候選內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR分析。并運(yùn)用BestKeeper（Pfaffl et al， 2004）、Normfinder（Andersen et al， 2004）和geNorm（Vandesompele et al， 2002）軟件綜合分析5個(gè)候選內(nèi)參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)穩(wěn)定性，以篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為開(kāi)展黃花大苞姜花藥發(fā)育相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以黃花大苞姜不同發(fā)育階段的花藥組織為材料，于5—7月采自廣東惠州南昆山自然保護(hù)區(qū)。收集花粉母細(xì)胞時(shí)期、四分體時(shí)期和成熟花粉時(shí)期的花藥組織，液氮速凍后，于-80 ℃保存，直至提取RNA。每個(gè)發(fā)育階段取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共9個(gè)樣品?；ㄋ幇l(fā)育階段經(jīng)醋酸洋紅壓片，顯微觀(guān)察確定。

1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA合成

用Omega BioTek公司的Plant RNA Kit（America）試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)方案二（用于次生代謝物多的植物組織）提取花藥組織的總RNA。RNase-free DNase 1（Takara Bio， Japan）去除RNA中的DNA。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano-100超微量分光光度計(jì)用于檢測(cè)RNA的純度和完整性。cDNA的合成采用PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaKa， Japan）試劑盒，取1.6 μg RNA，參照說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一條鏈，產(chǎn)物-20 ℃保存。

1.3 內(nèi)參基因的選擇及特異性引物設(shè)計(jì)

結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的常用內(nèi)參基因，以及其在本實(shí)驗(yàn)室3個(gè)階段發(fā)育花藥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的表達(dá)情況，以基因在3個(gè)花藥發(fā)育階段的表達(dá)量（FPKM）差異倍數(shù)均小于2為標(biāo)準(zhǔn)。最終確定表達(dá)量差異較小的GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6基因作為候選內(nèi)參基因。特異性引物的設(shè)計(jì)采用NCBI內(nèi)嵌的Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)，根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則，以及SYBR Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑對(duì)引物的要求選擇最優(yōu)引物，并將引物對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定引物的專(zhuān)一性。引物信息見(jiàn)表1。

1.4 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR反應(yīng)

采用BIO-RAD公司的CFX96TM Real-Time PCR Detection System進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，定量試劑采用SYBR Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara Bio， Japan）。反應(yīng)體系：cDNA 0.25 μL; SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL; Primer F（10 μmol·L-1）0.8 μL; Primer R（10 μmol·L-1）0.8 μL;加ddH2O補(bǔ)至20 μL體系。每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。生成溶解曲線(xiàn)，用于判斷擴(kuò)增特異性。

1.5 引物擴(kuò)增效率計(jì)算

等量取所有樣品的cDNA，混合均勻后稀釋5個(gè)梯度，每個(gè)梯度5倍，即模板濃度分別為初始濃度的1、1/5、1/52、1/53、1/54倍。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。用Bio Rad CFX Manager軟件分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以 Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到斜率K和相關(guān)系數(shù)R2。通過(guò)公式E=（5-1/k_1）×100%，計(jì)算引物擴(kuò)增效率（E）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用BestKeeper、geNorm和Normfinder 3個(gè)軟件對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。BestKeeper軟件可直接采用基因表達(dá)Ct值進(jìn)行分析，而geNorm和Normfinder軟件需將Ct值經(jīng)ΔCt方法轉(zhuǎn)換后才能用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

3個(gè)發(fā)育階段的黃花大苞姜花藥組織提取總RNA后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性和純度，結(jié)果顯示RNA電泳條帶清晰，無(wú)可見(jiàn)污染（圖1）。Nano-100檢測(cè)RNA的濃度和純度，結(jié)果表明A260/280均在2.0～2.1之間，表明RNA完整性好。A260/230在1.9～2.1之間，表明純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 擴(kuò)增效率與擴(kuò)增特異性分析

以5倍為濃度梯度稀釋5個(gè)梯度，qRT-PCR獲得的GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率、擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)（R2）見(jiàn)表1。5個(gè)候選內(nèi)參基因中除ACT6擴(kuò)增效率有點(diǎn)低只有77.8%，相關(guān)系數(shù)（R2）僅有0.889之外，GAPDH、MDH、TUA3、TUB7的引物擴(kuò)增效率E均大于100%，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.990，符合qRT-PCR對(duì)引物擴(kuò)增效率的要求。溶解曲線(xiàn)分析結(jié)果表明，5個(gè)候選內(nèi)參基因的溶解曲線(xiàn)均呈現(xiàn)明顯單一的主峰，相同樣品間的曲線(xiàn)重復(fù)性良好（圖2），說(shuō)明引物的特異性良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平分析

Ct值與基因的表達(dá)量呈反比，Ct值越大，基因的表達(dá)量越低;反之，Ct值越小，代表基因的表達(dá)量越高。5個(gè)候選內(nèi)參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育3個(gè)階段的Ct值見(jiàn)圖3，5個(gè)候選內(nèi)參基因在黃花大苞姜不同花藥發(fā)育階段中表達(dá)的Ct值在18～27之間，其中ACT6和TUB7的表達(dá)量較低，GAPDH的表達(dá)量最高。

2.4 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

BesterKeeper軟件是基于內(nèi)參基因Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和調(diào)節(jié)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差SD（±x - fold）來(lái)評(píng)判基因的表達(dá)穩(wěn)定性，直接對(duì)基因表達(dá)Ct值進(jìn)行分析。SD值越小，表達(dá)越穩(wěn)定，程序默認(rèn)臨界值為1，當(dāng)SD值大于1時(shí)，認(rèn)為該基因表達(dá)不穩(wěn)定。分析結(jié)果顯示，ACT6的SD值大于1，其余均小于1（表2），表明除ACT6之外，其余4個(gè)候選內(nèi)參均符合作為內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)，表達(dá)最穩(wěn)定的是TUB7。5個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序依次為T(mén)UB7>MDH>GAPDH>TUA3>ACT6。

geNorm V3.5軟件是基于平均表達(dá)穩(wěn)定值M來(lái)確定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)獲得的Ct值，需經(jīng)ΔCt方法轉(zhuǎn)換后方可用于分析。 M值越大，基因的表達(dá)穩(wěn)定性越低，M值越小，基因的表達(dá)越穩(wěn)定。一般認(rèn)為，M值等于1.5為基因表達(dá)穩(wěn)定的界限，M值大于1.5的基因， 不宜作為內(nèi)參基因。本研究5個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于不穩(wěn)定的是ACT6。5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性依次為MDH/TUB7>GAPDH>TUA3>ACT6（圖4：A）。此外，geNorm軟件還可以通過(guò)計(jì)算候選內(nèi)參基因的配對(duì)變異值Vn/n+1來(lái)分析最適內(nèi)參基因數(shù)。

軟件默認(rèn)Vn/n+1臨界值為0.15，即當(dāng)Vn/n+1<0.15時(shí)，n個(gè)內(nèi)參基因即可滿(mǎn)足內(nèi)參基因的要求。圖4：B結(jié)果顯示V3/4<0.15，即需要3個(gè)內(nèi)參基因MDH、TUB7和GAPDH組合來(lái)作為內(nèi)參基因。

NormFinder是基于組內(nèi)方差和組間方差來(lái)計(jì)算基因表達(dá)穩(wěn)定性的，基因表達(dá)的Ct值也需要經(jīng)ΔCt方法轉(zhuǎn)換后方可用于分析。穩(wěn)定值越大，代表基因的表達(dá)穩(wěn)定性越差，反之，穩(wěn)定性值越小代表，基因表達(dá)越穩(wěn)定。圖5結(jié)果表明ACT6的表達(dá)穩(wěn)定性最差，GAPDH的表達(dá)穩(wěn)定性最高。5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性依次為GAPDH>TUA3>MDH>TUB7>ACT6。

2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證

綜合考慮BestKeeper、geNorm和Normfinder 3個(gè)軟件的分析結(jié)果，認(rèn)為MDH和TUB7在黃花大苞姜花藥發(fā)育中表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定。分別以MDH和TUB7作為內(nèi)參基因，以PMC時(shí)期作為對(duì)照，采用ΔΔCT法，對(duì)黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中與淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的1，4-α-葡聚糖支鏈酶基因（1，4-alpha-glucan branching enzyme，GBE1）在花藥發(fā)育過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)模式進(jìn)行分析。并與花藥轉(zhuǎn)錄組中該基因的表達(dá)模式（FPKM）兩兩做相關(guān)系數(shù)分析（Pearson），來(lái)驗(yàn)證篩選出的表達(dá)相對(duì)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因的可靠性。結(jié)果表明，以MDH或TUB7作為內(nèi)參基因獲得的GBE1在花藥發(fā)育中的表達(dá)模式，與該基因在轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)模式相關(guān)系數(shù)r分別為0.966和0.946，它們兩個(gè)之間的相關(guān)系數(shù)r為0.998，表明3種途徑獲得的GBE1在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達(dá)模式一致，因此認(rèn)為MDH和TUB7可作為分析黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)模式的內(nèi)參基因。

3 討論與結(jié)論

qRT-PCR技術(shù)已被廣泛用于研究基因表達(dá)的研究，但是定量結(jié)果的準(zhǔn)確性與內(nèi)參基因的穩(wěn)定性表達(dá)密切相關(guān)，而并不存在所謂恒定表達(dá)的內(nèi)參基因（牙庫(kù)甫江等，2011;Huis et al， 2010; Chen et al， 2011）。Mallona et al（2010）篩選矮牽牛葉和花發(fā)育中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，NormFinder、BestKeeper、geNorm和qBasePlus 4種軟件綜合分析結(jié)果顯示，EF1a在Mitchell品系中最穩(wěn)定，CYP在V30品系中最穩(wěn)定，GAPDH在兩個(gè)品系中都最不穩(wěn)定。Xu et al（2014）對(duì)中國(guó)白菜花蕾發(fā)育中qRT-PCR內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，geNorm分析結(jié)果顯示可育系與不育系花蕾發(fā)育過(guò)程中表達(dá)最穩(wěn)定的是TUB和GAPDH。Jin et al（2013）分析了不同色系瓜葉菊花發(fā)育過(guò)程中的8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明在所有樣本中SAND和ACT最穩(wěn)定，但是在不同色系中的結(jié)果有所不同，藍(lán)色和粉紅色品系中SAND和ACT最穩(wěn)定，TIP41和ACT在白色系中最穩(wěn)定，PP2A和ACT在洋紅色系中最穩(wěn)定。而本研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)常用內(nèi)參基因GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6，在黃花大苞姜花藥發(fā)育過(guò)程中表達(dá)最穩(wěn)定的基因是MDH和TUB7，最不穩(wěn)定的基因是ACT6。因此篩選特定條件下，穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)τ跍?zhǔn)確分析目的基因的表達(dá)非常重要（Bustin et al， 2010）。

NormFinder、BestKeeper和geNorm軟件是目前最常用于評(píng)估內(nèi)參穩(wěn)定的軟件，但是由于采用不同的算法（Pfaffl et al， 2004;Andersen et al， 2004;Vandesompele et al， 2002），對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析結(jié)果會(huì)有一些差異，目前已經(jīng)有基于這些軟件的研究與分析，并得到了穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因（李晗等，2016;劉文哲等，2016;蘇曉娟等，2013;劉艷霞等，2016）。本研究也采用了這3個(gè)軟件對(duì)GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。BestKeeper分析結(jié)果顯示，除了ACT6以外，其余4個(gè)基因均符合作為內(nèi)參的要求，MDH和TUB7的表達(dá)最穩(wěn)定，ACT6的表達(dá)穩(wěn)定性最差。geNorm分析認(rèn)為5個(gè)候選內(nèi)參基因都符合作為內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)，MDH和TUB7的表達(dá)最穩(wěn)定，ACT6的表達(dá)穩(wěn)定性最差。而NormFinder則分析認(rèn)為表達(dá)最穩(wěn)定的基因是GAPDH和TUA3，ACT6表達(dá)穩(wěn)定性最差，但是MDH與TUB7的穩(wěn)定性值與最穩(wěn)定的GAPDH的差異不大。本研究選擇了表達(dá)較為穩(wěn)定的MDH和TUB7分別作為內(nèi)參基因分析GBE1在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達(dá)模式，并與該基因在花藥發(fā)育轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)模式做相關(guān)系數(shù)分析，該基因的3種表達(dá)模式結(jié)果一致。因此，認(rèn)為MDH和TUB7可作為qRT-PCR分析黃花大苞姜花藥發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)情況的內(nèi)參基因。

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