滕永康，叢日旭，劉云波(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

非人靈長類動物，因具有與人類高度遺傳同源性，在生物學研究中被廣泛應用[1]。普通綿耳狨猴是一種小型的非人靈長類動物，具有體型小，飼養(yǎng)成本低，繁殖效率高，方便實驗操作且不易攜帶猴B病毒等優(yōu)勢，目前，狨猴在生物醫(yī)學領(lǐng)域研究較為廣泛，尤其是在神經(jīng)科學，藥物動力學及藥物的毒性篩查[2]、自身免疫性疾病、感染性疾病動物模型，如登革熱[3]、丙型肝炎[4]方面都具有較大的潛能。然而，狨猴至今仍被定義為“實驗用動物”，即狨猴作為諸多學科研究用的非人靈長類實驗動物，相關(guān)的執(zhí)行標準正在擬定，很多生物學特性也亟待發(fā)掘。建立普通綿耳狨猴相關(guān)基礎(chǔ)生物學數(shù)據(jù)對于其實驗動物化培育及開展相關(guān)研究都至關(guān)重要，對于狨猴的血液學和血清生化檢測的研究，國外開展較早，Mcnees等[5]、Mcintosh等[6]相繼于1984年、1985年開展相關(guān)研究，而后，針對狨猴的血液學和血清生化檢測逐漸步入驗證和應用階段，如Omatsu等[7]通過血液學和血清生化指標數(shù)據(jù)變化直觀展現(xiàn)接種登革熱前后動物的生理表征。在國內(nèi)，繼1986年第一篇狨猴血液學檢查報道后，國內(nèi)尚未有針對普通綿耳狨猴的血液學和血清生化指標的更新報道，同時，血液學和血清生化學指標數(shù)據(jù)與取血方式[8]、樣本處理方式[9]以及動物因素如單籠或群居飼養(yǎng)[10]等多種因素相關(guān)，因此，隨著狨猴標準工作的逐步完善，有必要對本地狨猴群體血液學和血清生化各指標進行檢測和統(tǒng)計分析。為此，本文就本單位引進的實驗用狨猴群體，進行血液學和血清生化指標的檢測及統(tǒng)計分析，描述了本單位飼養(yǎng)的狨猴群體的血液及血清生化指標的測定數(shù)據(jù)，同時，對比Oliveira e Silva等研究者[11]報道的巴西雨林的野生狨猴群體以及邢鳳英等研究者[12]報道的獼猴非麻醉狀態(tài)下的各指標數(shù)據(jù)，加以分析比較，為狨猴血液及血清生化分析積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

就中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物北方資源中心2016年8月引進的實驗用普通綿耳狨猴群體，共取成年狨猴30只，其中雄猴21只，雌猴9只，年齡2～4歲，體重330～420 g[SCXK (京) 2014-0011]。飼養(yǎng)環(huán)境微生物質(zhì)量等級：普通環(huán)境；飼養(yǎng)條件：單籠飼養(yǎng)或成對飼養(yǎng)，籠具尺寸60 cm × 80 cm × 110 cm，籠內(nèi)擺放干木條和木盒作為豐容措施，動物室溫度維持在24℃～29℃，濕度控制為> 40%，12 h光照/黑暗循環(huán)控制[SYXK (京) 2017-0027]。每日飼喂配合飼料，輔以清潔水果，自由飲水。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)。血液學測定采用全自動血液分析儀(ABX Pentra DX120，法國)，血清生化分析測定采用全自動生化分析儀(日立7100，日本)，血樣離心使用Thermo Fresco 21型離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 血樣采集

采樣時間為6月份，在動物清醒空腹狀態(tài)下，人工保定，保持動物俯臥姿勢，伸展后肢，使用1 mL一次性無菌注射器分兩次通過后肢靜脈穿刺，針頭規(guī)格為26G，共采集1.1 mL全血，其中乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血0.4 mL，用于血常規(guī)檢測，非抗凝血0.7 mL，3000 r/min離心15 min，分離得血清，用于血清生化指標檢測，血液學及血清生化指標檢測在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所GLP中心檢驗室完成，測定方法參考馮仁豐[13]方法。

1.3.2 血液學指標測定

在采血后1.5 h內(nèi)，應用全自動血液分析儀，設(shè)定猴類種屬，圈定細胞亞群，檢測以下血液學指標：白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細胞壓積(HCT)、紅細胞平均容量(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白容量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度(RDW)、血小板計數(shù)(PLT)、平均血小板容量(MPV)、血小板比容(PCT)、中性粒細胞百分比(NEUT%)、淋巴細胞百分比(LYMPH%)、單核粒細胞百分比(MONO%)、嗜堿性粒細胞百分比(BASO%)、嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)。

1.3.3 血清生化指標測定

在采血后2 h內(nèi)，應用全自動生化分析儀上樣檢測以下血清生化指標：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、鈣(Ca)、磷(P)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 血液學測定結(jié)果

對比巴西雨林野外條件的狨猴群體，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體中的HGB、MCHC、NEUT指標數(shù)據(jù)均有明顯差別，而與相應性別組的獼猴指標數(shù)據(jù)相近。對比獼猴血液學指標可以看出，狨猴的血液學大部分指標數(shù)據(jù)大部分落在獼猴血液學指標數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間內(nèi)，其中，雌性狨猴的WBC、RBC、HCT、MCH均值未處在雌性獼猴區(qū)間內(nèi)，而雄性狨猴僅有HCT指標數(shù)據(jù)與雄性獼猴差距較大。

2.2 血清生化測定結(jié)果

對比巴西大西洋沿岸森林的狨猴群體，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體的ALT、AST、GLOB指標數(shù)據(jù)明顯升高，雌雄組規(guī)律相同。與雌性獼猴指標數(shù)據(jù)區(qū)間相比，雌性狨猴的ACT、GGT、CREA指標數(shù)據(jù)未處在獼猴參考值范圍內(nèi)，雄性狨猴除了雌猴對比的三個指標差別較大外，還有ALP指標數(shù)值偏低。

表1 普通綿耳狨猴血常規(guī)指標的比較Tab.1 Comparison of hematological parameters in common marmosets

表2 普通綿耳狨猴血清生化學指標的比較Tab.2 Comparison of serum biochemical parameters in common marmosets

注：與雌猴組血清生化指標相比，*P< 0.05。

Note.Compared with serum biochemical parameters of the female group,*P< 0.05.

3 討論

與嚙齒類動物相比，非人靈長類動物因具有部分獨到的優(yōu)勢，已經(jīng)并且將繼續(xù)被用于更多的藥理學和毒理學，傳染病學等研究。本研究選取30只營養(yǎng)狀態(tài)良好的普通綿耳狨猴，在動物空腹清醒狀態(tài)下，后肢靜脈采血，并在2 h內(nèi)完成檢測工作，檢測試劑耗材可以保證實驗結(jié)果的可靠性。

從雌猴雄猴組間差異比較，血清生化測定結(jié)果中，LDL-C、HDL-C指標差異有顯著性，可能與雌、雄猴的飲食量和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)有關(guān)。對比的數(shù)據(jù)中，第一組數(shù)據(jù)來源為巴西大西洋沿岸的野生狀態(tài)下的狨猴，與本研究動物種屬一致，動物捕捉后使用10 mg/kg鹽酸氯胺酮麻醉，后肢靜脈采血進行檢測[11]；第二組數(shù)據(jù)來源為經(jīng)人工繁育三代的獼猴群體[12]，考慮到氯胺酮誘導[14]對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，因此選擇此數(shù)據(jù)作為獼猴屬參考數(shù)據(jù)。血液學檢測結(jié)果對比，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體中的HGB、MCHC、NEUT指標數(shù)據(jù)均有明顯差別，其中，HGB、MCHC指標數(shù)據(jù)相差近10倍，這兩個指標數(shù)據(jù)與獼猴相近，血紅蛋白位于紅細胞內(nèi)，是紅細胞的主要組成成分，巴西雨林的狨猴中血紅蛋白可能與巴西大西洋沿岸雨林食物供應不穩(wěn)定的生存環(huán)境有關(guān)。血清生化檢測結(jié)果對比，較巴西大西洋沿岸森林的狨猴，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體的ALT、AST、GLOB指標數(shù)據(jù)明顯升高，雌雄組規(guī)律相同。ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于肝臟、心臟組織細胞中，當組織發(fā)生病變時，該酶活力增多；AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶，主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中，AST在血清含量較高提示肝臟可能損傷，鑒于動物群體檢疫合格，個體狀態(tài)良好，與獼猴對應指標數(shù)據(jù)比較，ALT、AST指標值相差不大，猜測可能與野外生存環(huán)境下的特殊體質(zhì)有關(guān)，同時與肝功相關(guān)的指標GGT，本單位飼養(yǎng)的狨猴比獼猴測定值較低，提示肝功未有異常，此處原因尚不明確，是否動物狀態(tài)有關(guān)，還需要做肝臟活檢等檢測加以佐證。與雌性獼猴指標數(shù)據(jù)區(qū)間相比，雌性狨猴的ACT、GGT、CREA指標數(shù)據(jù)沒有處在獼猴正常值范圍內(nèi)，雄性狨猴除了雌猴對比的三個指標差別較大外，還有ALP指標數(shù)值偏低，可能是狨猴與獼猴種屬差異。

與同屬新大陸猴的卷尾猴[15]和松鼠猴[16]相比，狨猴與卷尾猴的血液學指標均值差異不大，與松鼠猴一致性極高。血清生化檢測結(jié)果中，狨猴與卷尾猴存在差異的指標有ALT、AST、GGT、ALP、ALB、TP、LDH，其中相差較大的是TP和GGT，狨猴TP均值高于卷尾猴近10倍，而GGT均值又約是卷尾猴的1/10，造成差異的原因除了種間差異外，還可能跟卷尾猴野外生存的營養(yǎng)狀態(tài)以及囚禁狀態(tài)下的應激反應有關(guān)。國內(nèi)對狨猴血液學的探究始于1986年陳天培等[17]對四只綿耳狨猴的血液學檢查的報道，本研究對普通綿耳狨猴的各項血液學和血清生化的大部分指標的范圍與先前報道基本一致，其中LDH、PLT均值略低，可能與動物營養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)環(huán)境差異有關(guān)。對比潘振業(yè)等[18]報道的白須狨猴的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，普通綿耳狨猴LDH、ALB、CREA均值較高，而WBC、ALT、AST、BUN指標均值則較低，結(jié)果與種間差異有關(guān)，也可能是與氯胺酮誘導麻醉有關(guān)。

本研究對本單位飼養(yǎng)的30只普通綿耳狨猴進行血液學和血清生化指標進行測定，建立普通綿耳狨猴血液學和血清生化學各項指標數(shù)據(jù)的背景資料，為藥理、毒理研究以及狨猴疾病診療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻：

[1] 田朝陽, 楊守凱. 非人靈長類動物在醫(yī)學科學實驗中的應用 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2009, 19(6): 74-77.

[2] Smith D, Trennery P, Farningham D, et al. The selection of marmoset monkeys (Callithrixjacchus) in pharmaceutical toxicology [J]. Lab Anim, 2001, 35(2): 117-130.

[3] Omatsu T, Moi ML, Hirayama T, et al. Common marmoset (Callithrixjacchus) as a primate model of dengue virus infection: development of high levels of viraemia and demonstration of protective immunity [J]. J Gen Virol, 2011, 92(Pt 10): 2272-2280.

[4] 帥麗芳, 李婷婷, 陳姿喧, 等. GBV-B與HCV嵌合病毒狨猴感染模型的建立 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2010, 20(10): 73.

[5] Mcnees DW, Lewis RW, Ponzio BJ, et al. Blood chemistry of the common marmoset (Callithrixjacchus) maintained in an indoor-outdoor environment: primate comparisons [J]. Primates, 1984, 25(1): 103-109.

[6] Mcintosh GH, Lawson CA, Rodgers SE, et al. Haematological characteristics of the common marmoset (Callithrixjacchusjacchus) [J]. Res Vet Sci, 1985, 38(1): 109-114.

[7] Omatsu T, Moi ML, Takasaki T, et al. Changes in hematological and serum biochemical parameters in common marmosets (Callithrixjacchus) after inoculation with dengue virus [J]. J Med Primatol, 2012, 41(5): 289-296.

[8] 田蜜, 蔣雪云, 曹麗歌, 等. 不同取血方式及性別對成年Wistar大鼠11種血液生物化學指標的影響 [J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2017, 38(4): 572-575.

[9] 朱科燕, 蔡月琴, 徐孝平, 等. 血液樣本處理方式對Wistar大鼠血液生化指標檢測結(jié)果的影響 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2016, 26(11): 80-84.

[10] 宋征, 李華, 阮斌, 等. 群體飼養(yǎng)對比格犬血液學及生化指標的影響 [J]. 動物醫(yī)學進展, 2017, 38(8): 71-75.

[11] Oliveira e Silva I, Fátima Rodrigues da Silva F, Fuzessy L, et al. Hematology and blood biochemistry in wild hybrid marmosets from the Atlantic Forest, Brazil [J]. Ciência Rural, 2014, 44(9): 1596-1602.

[12] 邢鳳英, 嚴國鋒, 楊偉敏, 等. 3～4歲獼猴生理指標的測定 [J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2013, 33(4): 310-314.

[13] 馮仁豐.實用醫(yī)學檢驗學[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1996：267-488.

[14] 程樹軍, 黃韌. 氯胺酮麻醉對恒河猴血液學指標的影響 [J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2003, 39(3): 23-25.

[15] Monteiro FOB, Monteiro MVB, Scofield AA, et al. Hematological and biochemistry evaluation in capuchin monkeys from the illegal captivity [J]. Acta Veterinaria Brasilica, 2016, 10(1): 92-97.

[16] 周世賢, 陶勇, 杜文鵬, 等. 松鼠猴血液生理指標的測定 [J]. 野生動物學報, 2008, 29(2): 72-73.

[17] 陳天培, 潘振業(yè), 李建平, 等. 狨猴研究Ⅲ—血液學檢查 [J]. 上海實驗動物科學, 1986, 6(2): 88-90.

[18] 潘振業(yè), 鄒勇, 馬東林, 等. 白須狨猴血液學初步測定 [J]. 動物學雜志, 1988, 23(1): 51-54.