呼奶英，于佳田，別會杰，王德廣(徐州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，江蘇 徐州 221004)

癲癇(epilepsy)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以腦內(nèi)神經(jīng)元突發(fā)性異常放電為著。其持續(xù)存在的自發(fā)反復發(fā)作對患者身體、生活、心理、認知等造成嚴重影響，并可伴隨終身[1]。因此，其病因及發(fā)病機制一直是研究的重點，但尚未完全闡明[1-3]。目前，普遍接受的學說是神經(jīng)元及神經(jīng)環(huán)路興奮性-抑制性系統(tǒng)的失衡。另與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)及受體改變、血腦屏障破壞、離子通道異常、突觸重塑、膠質(zhì)細胞增生、神經(jīng)發(fā)生、基因突變、免疫、遺傳等有關(guān)[3]。也有研究表明，癲癇發(fā)生發(fā)展中存在包括DNA甲基化、組蛋白去乙酰化等異常的表觀遺傳學修飾，廣泛影響癲癇相關(guān)基因的表達[4 - 5]，這可能是重要的發(fā)病因素之一。

神經(jīng)元限制性沉默因子(repressor element silencing transcription factor，REST)是一種Cys2/His2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元的發(fā)育及疾病中具有重要的作用，與DNA中的神經(jīng)元限制性沉默元件RE-1結(jié)合，修飾DNA、組蛋白及染色質(zhì)等，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響神經(jīng)元離子通道的表達、突觸形成及傳遞和神經(jīng)元的發(fā)生，從而影響神經(jīng)元興奮性等[5-6]。癲癇動物模型的研究表明，海馬區(qū)REST表達上調(diào)，可調(diào)控生長因子、離子通道蛋白、細胞間縫隙連接、神經(jīng)遞質(zhì)受體等的表達。海人酸誘導癲癇大鼠中，REST表達上調(diào)可抑制Calb1、Glra2、Grin2a、Hcn1、Kcnc2、Klf9和Myo5b等基因的表達，影響改變離子通道性質(zhì)，紊亂神經(jīng)元或神經(jīng)環(huán)路興奮性-抑制性平衡系統(tǒng)，參與癲癇的發(fā)生[7]。McClelland等人[8]進一步研究已明確，超級化激活環(huán)核苷酸陽離子通道(HCN1)的表達于癲癇發(fā)生后受到REST的顯著抑制，以致對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性的抑制作用降低，加速癲癇的形成。杏仁核快速電點燃癲癇模型是目前難治性癲癇研究中公認的理想模型之一[9]，其中REST的表達變化情況及其相關(guān)研究卻鮮有報道。因此，本研究旨在探究癲癇發(fā)生后不同時間內(nèi)REST表達變化，揭示其變化規(guī)律及其可能的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠24只，體重250～300 g，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK (蘇) 2015-0009]。所有大鼠在徐州醫(yī)科大學動物中心動物房飼養(yǎng)[SYXK (蘇) 2016-0028]，屏障環(huán)境，室溫22～25℃，濕度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，每日提供充足標準食物與飲水。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗REST多克隆抗體購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司，鼠抗NeuN單克隆抗體購自美國Sigma公司；生物素化羊抗鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；YLS-9A生理、藥理電子刺激儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)；研究級系統(tǒng)顯微鏡BX-41(日本奧林巴斯株式會社)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

24只大鼠隨機分為假手術(shù)組(S組)、癲癇模型2 h組(EP-2 h組)、癲癇模型14 d組(EP-14 d組)和癲癇模型35 d組(EP-35 d組)。

1.3.2 癲癇模型制作

采用杏仁核快速電點燃癲癇模型，參考本實驗室前期制作方法[10 - 11]。大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀上，沿頭部正中矢狀位切開皮膚1.5～2 cm，充分暴露顱骨及前囟、冠狀縫、矢狀縫，參照Paxinos和Watson[12]的大鼠腦立體定位圖譜確定杏仁基外側(cè)核(basolateral amygdaloid nucleus，BLA)坐標(AP=-2.0 mm，ML=-5.0 mm，DV=-8.3 mm)，顱鉆鉆孔，按照上述坐標頭部植入雙螺旋電極。術(shù)后恢復1周，采用恒流電刺激右側(cè)杏仁基外側(cè)核，隔日刺激，刺激參數(shù)為恒流電雙相方波、波寬l ms、頻率為60 Hz、持續(xù)時間2 s，每日刺激均從10 μA電流強度開始，逐漸增加電流至70 μA或誘發(fā)出V級癲癇，大鼠行為學變化參考Racine法[13]分級。其中V級發(fā)作為繼發(fā)性全身性癲癇發(fā)作，如果動物連續(xù)三次出現(xiàn)V級發(fā)作，即被完全點燃(kindled)。假手術(shù)組大鼠按照上述方法只植入電極，不予刺激。本研究過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷，充分考慮動物福利原則，尊重善待動物，最大程度減少對動物的傷害和動物的痛苦。

1.3.3 灌注、取腦及冰凍切片

末次刺激后2 h、14 d、35 d，大鼠麻醉灌注、取腦后固定，30%蔗糖沉底后行連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm。

1.3.4 NeuN/REST免疫組織化學染色

取各組大鼠腦片入3% H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育30 min，10%羊血清室溫封閉2 h，入鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶100)或兔抗鼠REST多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育48 h，生物素化羊抗鼠/兔IgG(1∶200)室溫孵育4 h，鏈霉卵白素-HRP(1∶200)室溫孵育2 h，DAB/H2O2顯色觀察。貼片、酒精脫水，二甲苯透明和封片。

1.3.5 圖像數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)NeuN免疫組織化學染色結(jié)果

結(jié)果顯示杏仁核快速電點燃癲癇完全點燃后2 h時，海馬CA1、CA3和DG區(qū)域NeuN陽性神經(jīng)元未發(fā)生明顯變化；14 d、35 d時，該區(qū)域NeuN陽性神經(jīng)元丟失明顯，細胞間距增大、排列松散、染色淺淡。見圖1。量化分析顯示，與假手術(shù)組比較，EP-2 h組差異無顯著性(P> 0.05)，EP-14 d和EP-35 d組NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)丟失明顯(P< 0.05)。見圖2。

注：A～D：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點燃癲癇2 h組、杏仁核電點燃14 d組、杏仁核電點燃癲癇35 d組CA1部位NeuN表達；A1～D1：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點燃癲癇2 h組、杏仁核電點燃14 d組、杏仁核電點燃癲癇35 d組CA3部位NeuN表達；A2～D2：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點燃癲癇2 h組、杏仁核電點燃14 d組、杏仁核電點燃癲癇35 d組DG部位NeuN表達。圖1 杏仁核電刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬區(qū)NeuN表達減少Note.A-D: Expression of NeuN in the hippocampal CA1 region of rats in the sham group, electrical amygdala kindling epilepsy 2 h group, electrical amygdala kindling epilepsy 14 d group, electrical amygdala kindling epilepsy 35 d group. A1-D1: Expression of NeuN in the hippocampal CA3 region of rats in those four groups. A2-D2: Expression of NeuN in the hippocampal DG region of rats in those four groups.Fig.1 NeuN immunohistochemistry was decreased in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

注：EP-2 h組、EP-14 d組和EP-35 d組海馬CA1、CA3、DG部位NeuN陽性細胞數(shù)與假手術(shù)組相同部位比較，*P< 0.05。圖2 杏仁核電刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬NeuN陽性細胞數(shù)減少Note.The number of NeuN positive neurons in the hippocampal CA1, CA3 and DG regions of rats in the group EP-2 h, group EP-14 d and group EP-35 d was compared with that in the same regions of rats in the sham group,*P< 0.05.Fig.2 The number of NeuN positive neurons was decreased in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

注：A～D：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點燃癲癇2 h組、杏仁核電點燃14 d組、杏仁核電點燃癲癇35 d組CA1部位REST表達；A1～D1：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點燃癲癇2 h組、杏仁核電點燃14 d組、杏仁核電點燃癲癇35 d組CA3部位REST表達；A2～D2：分別為假手術(shù)組、杏仁核電點燃癲癇2 h組、杏仁核電點燃14 d組、杏仁核電點燃癲癇35 d組DG部位REST表達。圖3 杏仁核刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬CA1、CA3和DG部位REST表達上調(diào)Note.A-D: Expression of REST in the hippocampal CA1 region of rats in the sham group, electrical amygdala kindling epilepsy 2 h group, electrical amygdala kindling epilepsy 14 d group, electrical amygdala kindling epilepsy 35 d group. A1-D1: Expression of REST in the hippocampal CA3 region of rats in those four groups. A2-D2: Expression of REST in the hippocampal DG region of rats in those four groups.Fig.3 REST immunohistochemistry was increased in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

2.2 各組大鼠海馬各區(qū)REST免疫組織化學染色結(jié)果

結(jié)果顯示海馬CA1、CA3和DG區(qū)錐體細胞層REST表達明顯，REST陽性表達位于細胞核，棕褐色。杏仁核快速電點燃癲癇完全點燃后2 h時，海馬CA1、CA3和DG區(qū)錐體細胞層REST陽性表達明顯增加；14 d、35 d時，該區(qū)域REST陽性表達較假手術(shù)組稍有增加。見圖3。量化分析顯示，與假手術(shù)組比較，EP-2 h組、EP-14 d和EP-35 d組REST陽性表達明顯上調(diào)(P< 0.05)。見圖4。

注：EP-2 h組、EP-14 d組和EP-35 d組海馬CA1、CA3和DG部位REST積分光密度值與假手術(shù)組相同部位比較，*P< 0.05。圖4 杏仁核刺激大鼠癲癇發(fā)生后海馬REST表達上調(diào)Note.The intergraloptical density of REST in the hippocampal CA1, CA3 and DG regions of rats in the group EP-2 h, group EP-14 d and group EP-35 d was compared with that in the same regions of rats in the sham group,*P< 0.05.Fig.4 REST expression was higher in the hippocampus of rapid amygdala kindling epilepsy rats compared with the sham group

3 討論

顳葉癲癇作為癲癇疾病最為常見的類型，以大腦內(nèi)神經(jīng)元突發(fā)性異常放電為著，神經(jīng)元興奮性升高及突觸重塑是重要的病理生理改變。但其復雜的發(fā)病機制目前尚不清楚[14]。近來相關(guān)研究表明，REST可限制性沉默神經(jīng)元特異性基因，這不僅在神經(jīng)發(fā)生發(fā)育中具有重要作用，在成熟神經(jīng)元、亨廷頓、癲癇等疾病中亦具有重要作用[15]。癲癇發(fā)生后，REST通過調(diào)控相關(guān)基因表達，改變神經(jīng)元離子通道及受體的數(shù)量活性或分布、海馬苔蘚纖維出芽、突觸重塑等，影響神經(jīng)元膜電位分布、細胞信號傳導及神經(jīng)傳導等，造成神經(jīng)元過度興奮[5]，這在癲癇疾病中可能起著重要作用。

本研究采用杏仁核快速電點燃方式建立成年大鼠癲癇模型，檢測到海馬區(qū)NeuN的表達于癲癇發(fā)生后14 d、35 d出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元丟失，這與目前研究認為的癲癇發(fā)生后海馬硬化的特征性改變一致[16]。顳葉癲癇發(fā)生可引起海馬部位明顯的神經(jīng)元死亡的同時也會引起神經(jīng)發(fā)生[17-19]，這可能與REST表達變化相關(guān)。本研究中檢測到杏仁核快速電點燃癲癇大鼠海馬組織錐體細胞及DG顆粒細胞中REST表達持續(xù)上調(diào)，2 h達峰。REST持續(xù)上調(diào)，選擇性識別結(jié)合癲癇相關(guān)基因中的RE-1元件，在轉(zhuǎn)錄水平對相關(guān)靶基因表達進行沉默或抑制，改變神經(jīng)元離子通道數(shù)量或特性、突觸結(jié)構(gòu)等，致使神經(jīng)元興奮性升高或(和)局部興奮性突觸環(huán)路形成，癲癇易感性增加。海馬組織是腦內(nèi)與癲癇發(fā)生密切相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)之一，其中有近600多種編碼離子通道、受體及其它影響神經(jīng)元功能的基因[20]均含有RE-1元件，且成年大鼠海馬區(qū)是腦內(nèi)REST含量最高的區(qū)域之一，因此，該區(qū)域REST相關(guān)作用十分重要且復雜。McClelland等人[7 - 8]的研究表明，癲癇發(fā)生后海馬組織內(nèi)REST表達上調(diào)，其中Ca2+相關(guān)基因Calb1、Myo5b和Grin2a，K+相關(guān)基因Kcnc2和Klf9，以及Cl-相關(guān)基因Glra2等基因中的RE-1元件與REST結(jié)合增強，染色質(zhì)發(fā)生持續(xù)性改變，相應的基因產(chǎn)物表達持續(xù)下調(diào)，神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度增加和(或)Cl-內(nèi)流減少等變化，導致神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+超載或Cl-穩(wěn)態(tài)失衡，綜合引起神經(jīng)元興奮性增高，致使癲癇反復發(fā)作或發(fā)作的易感性增高。研究也表明，對于維持神經(jīng)元興奮性十分重要的離子型谷氨酸受體GLUA2、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF等的表達，也受REST的調(diào)控[5]。選擇性敲除小鼠前腦REST基因，海馬區(qū)相關(guān)靶基因產(chǎn)物成纖維細胞生長因子FGF14及腦源性生長因子BDNF表達上調(diào)，DG顆粒細胞軸突出芽增加，形成異常局部興奮性突觸環(huán)路，癲癇易感性增加[21]。因此REST也有可能是抑制癲癇發(fā)作內(nèi)源性因子。

總之，REST作為一種作用廣泛的神經(jīng)元限制性沉默因子，與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)，受其抑制的基因以及潛在可被抑制的基因眾多[22 - 23]。杏仁核快速電刺激癲癇大鼠海馬REST的持續(xù)顯著上調(diào)，可能引起相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及受體、離子通道蛋白等相關(guān)基因產(chǎn)物的表達變化，進而影響神經(jīng)元興奮性或神經(jīng)環(huán)路興奮性傳導，參與癲癇的發(fā)生[15,20,24]。對于杏仁核快速電點燃癲癇大鼠中REST的相關(guān)作用，將進行進一步深入的研究。

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