(1 青島大學公共衛(wèi)生學院，山東 青島 266021； 2 青島市標準化研究院)

銅是一種非常重要的微量元素。它不僅參與蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，而且在人體骨骼發(fā)育、生殖、凝血等生理功能中起著重要的作用。然而，環(huán)境重金屬污染已成為全球問題，環(huán)境銅污染也日趨嚴重。銅是工業(yè)中常用的重金屬，一項對電子垃圾拆除中心周圍居住人群的血清銅和尿銅的研究檢測結(jié)果顯示，暴露組人群和對照組人群的血清銅和尿銅水平均有顯著差異[1]。同時，銅具有的促生長和殺菌作用，使得人們在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上大量使用銅相關(guān)制劑[2-4]。銅蓄積或代謝異?？梢詫е耊ILSON病[5]和MENKE病[6]，銅過載與神經(jīng)性疾病如阿爾茨海默病(AD)等疾病的發(fā)生也有關(guān)系[7-8]。近年來，隨著腫瘤研究的深入，銅與腫瘤的關(guān)系也逐漸成為人們關(guān)注的焦點，銅可能是影響人類腫瘤生長的重要因素。臨床流行病學調(diào)查顯示，部分癌癥病人血清銅含量明顯高于健康人群，與腫瘤的發(fā)生間存在著相關(guān)性，如口腔癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌和腦瘤等[9-14]，并且適量的銅缺乏是能夠抑制腫瘤發(fā)生的[15-16]。本實驗在前期細胞實驗研究的基礎(chǔ)上，通過建立H22荷瘤小鼠的模型，選擇適量的銅濃度給小鼠灌胃，觀察銅對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及肝功能和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

SPF級昆明小鼠80只，體質(zhì)量18～22 g，購于山東魯抗藥業(yè)公司(許可證號scxk(魯)20140007)。適應性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機分為灌胃給水組(A組)，灌胃給水+四硫鉬酸銨鹽(TM)組(B組)，分別灌胃給予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸銅組(C、D、E組)，分別灌胃給予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸銅+1 mg/kg TM組(F、G、H組)，每組10只小鼠，小鼠每日自由進水、進食。

1.2 各組處理與模型制備

根據(jù)上述的分組，用不同濃度的硫酸銅溶液給小鼠灌胃4周，使小鼠體內(nèi)獲得一定量的銅蓄積。隨后，將H22腹水瘤細胞接種于小鼠右腿部，建立H22肝癌小鼠移植瘤模型(抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，在顯微鏡下通過錐蟲藍染色計數(shù)(>95%)，通過PBS將細胞數(shù)調(diào)至1×109/L。隨后，以每只5×109個細胞/L接種在小鼠的右后腿)。然后，根據(jù)相應的分組及硫酸銅繼續(xù)持續(xù)灌胃4周。9周后，將全部小鼠處死，眼球取血。取出移植瘤及肝、脾、胸腺等臟器并稱量。

1.3 觀察指標及測定方法

1.3.1腫瘤發(fā)生情況及體積變化 在接種腫瘤后，每3 d測量一次腫瘤的長和寬并記錄，根據(jù)公式計算瘤體積(V)，公式如下：V=長×寬×寬/2。

1.3.2肝功能及脾臟和胸腺指數(shù)計算 實驗結(jié)束后，小鼠禁食12 h。眼球取血后，取小鼠的胸腺和脾臟并稱量，通過公式計算出小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)。公式如下：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/(小鼠體質(zhì)量×10)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/(小鼠體質(zhì)量×10)

1.3.3ICP-MS檢測血清銅的含量 取血清0.2～0.5 g。將試樣置于聚四氟乙烯消解罐中，然后加入6 mL硝酸，再加入1 mL過氧化氫，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中消解，程序為升溫至200 ℃，后加熱時間10 min,控制溫度200 ℃，持續(xù)時間20 min，冷卻時間30 min。隨后按照儀器操作規(guī)程，調(diào)整儀器至最佳狀態(tài)。待儀器穩(wěn)定后，按順序依次對標準溶液、空白溶液和試樣進行測定。所得結(jié)果按照以下公式進行計算：X=c×10/m×1000 (X:銅含量，c:當前試樣銅濃度，m: 試樣質(zhì)量)。

1.4 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)mRNA的表達

利用Trizol提取腫瘤組織中的mRNA，用痕量核酸儀檢測mRNA的濃度和純度。隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用PCR儀檢測VEGF和bFGF的表達。檢測條件如下：95℃預變性5 min；然后95℃變性10 s,60 ℃退火30 s，共進行50個循環(huán)。引物序列：bFGF F：5′-ACGG-CTGCTGGCTTCTAAGT-3′，R：5′-CAGTGCCA-CATACCAACTGGA-3′；VEGF F：5′-CACCAAA-GCCAGCACATAGG-3′，R：5′-ACCCTTTCCCTT-TCCTCGAA-3′。

2 結(jié) 果

2.1 各組H22荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤的生長變化

實驗結(jié)束后，A、B、C組和F組各有1只小鼠死亡，D組中有2只小鼠死亡，E組和H組中有3只小鼠死亡，G組中有4只小鼠死亡。實驗結(jié)果顯示，與A、F、G、H組相比，D、E組腫瘤均有不同程度的增長，差異具有顯著意義(F=9.034，P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠肝功能指標及胸腺、脾臟指數(shù)比較

各組小鼠AST、ALT、ALB及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠血清銅水平

A～E組血清銅水平分別為(1.43±0.20)、(1.39±0.17)、(1.55±0.22)、(1.64±0.48)、(1.92±0.27)、(1.51±0.35)、(1.23±0.15)、(1.51±0.35)mg/kg，E組血清銅水平與A組相比顯著增高，差異有顯著性(F=3.803,P<0.05)。

2.4 血清銅與腫瘤質(zhì)量的相關(guān)性分析

隨機抽取32例血清樣本，檢測結(jié)果顯示，血清銅的水平平均為(1.51±0.35)mg/kg，腫瘤質(zhì)量平均為(3.84±1.11)g，血清銅水平與腫瘤質(zhì)量具有相關(guān)性(r=0.316，P<0.05)。

2.5 各組小鼠腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達水平比較

A～E組腫瘤組織中VEGF mRNA的相對表達水平分別為0.29±0.004、0.02±0.001、0.26±0.011、0.34±0.012、0.39±0.016、0.06±0.046、0.01±0.001、0.01±0.001；A～E組小鼠腫瘤組織中bFGFmRNA表達水平分別為0.28±0.016、0.02±0.001、0.15±0.007、0.25±0.051、0.92±0.27、0.02±0.014、0.04±0.003、0.01±0.001。C、D、E組與A組相比，腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達水平升高，差異有顯著性(F=40.118、197.090,P<0.05)。

表1 各組H22荷瘤小鼠體質(zhì)量及瘤質(zhì)量的變化

表2 各組小鼠肝功能指標及胸腺、脾臟指數(shù)比較

3 討 論

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)全國第3次死因回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤中，原發(fā)性肝癌引起的死亡人數(shù)已從第3位升高到第2位[17]，嚴重危害著我國居民的健康，給人類造成了巨大的疾病負擔。

肝癌的發(fā)生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結(jié)果，但病因機制尚未完全闡明，肝癌的預防仍然是臨床上的難題。肝臟作為銅蓄積的主要器官，當銅的蓄積超過肝臟代謝的閾值時，會損害肝細胞，引起多種疾病，如WILSON病[5]和MENKE病[6]。銅過量可引起細胞發(fā)生氧化應激，從而產(chǎn)生活性氧(ROS)，ROS可以造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA損傷。ROS同時也是導致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素[18]。研究顯示，肝對銅負載會啟動自身的保護機制，即使沒有發(fā)生臨床、生化和形態(tài)上的變化，肝細胞中HGFb和NF-κB的表達也會增加，進而增加肝損傷的風險[19]。以往有關(guān)銅的研究多是選擇超過機體可承受范圍多倍的銅濃度，用以觀察高銅對動物的毒性作用；而有關(guān)機體可承受的銅濃度對機體的作用主要集中在體外細胞系的研究。但是，人類在現(xiàn)實生活中接觸高濃度銅的機會卻很少。所以本實驗研究所采用的銅和TM的劑量，是根據(jù)中國營養(yǎng)學會(CNS)建議的成人銅的適宜攝入量(AI)為2 mg/d，最高可耐受攝入量(UL)為8 mg/d計算出來的。當成人每日攝入0.8～7.5 mg銅時，機體中的血漿銅濃度、紅細胞超氧化物歧化酶、血漿銅藍蛋白和尿銅無明顯變化[20]；當機體攝入1 mL的TM時，可以降低人體20%的血銅，既有效地抑制促血管發(fā)生因子的釋放，又不會對機體產(chǎn)生副作用，機體也能長期耐受[21]。本實驗結(jié)果顯示，各組小鼠肝功能血清理化指標間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明本實驗所選用的銅和TM的濃度在實驗周期內(nèi)未對小鼠的肝臟和免疫系統(tǒng)造成損傷。

多數(shù)腫瘤的生長需要銅離子的參與[22]，長期飲用高銅濃度(公眾供水系統(tǒng)中規(guī)定的最高含量)的水能加速癌細胞的生長[23]。這些研究提示，銅可能是影響腫瘤生長的重要因素。腫瘤細胞的高增殖速率相比于正常形態(tài)功能的細胞來說，需要更多的銅離子來滿足其對生長、增殖所需的環(huán)境條件要求。本實驗結(jié)果顯示，隨著銅濃度的升高，H22荷瘤小鼠的腫瘤的大小和體積也隨之增加，呈劑量反應關(guān)系；血清銅水平也隨銅濃度的增加而升高，并與腫瘤質(zhì)量具有相關(guān)性，這與銅和乳腺癌關(guān)系的研究結(jié)果相一致[24]。

腫瘤生長需要許多因素的參與，腫瘤中血管的生成也是腫瘤生長的眾多重要因素之一。腫瘤細胞不僅能夠分泌血管生長因子，而且能夠促進腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖。腫瘤血管是由血管生成因子的釋放所介導的，血管生成因子主要包括VEGF、bFGF和TGF等，其中，VEGF是被認為最重要的血管生成因子[25]，VEGF信號通路在血管生成的全過程中發(fā)揮不可替代的作用。已有的研究表明，在血管生成的過程中，VEGF通過多種途徑參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等[26-27]。bFGF是最強的腫瘤血管生長因子，其異常表達可促進細胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤形成[28]。為了深入探討銅和TM對H22移植瘤中VEGF和bFGF的影響，本實驗采用RT-PCR方法檢測了腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達水平，結(jié)果顯示，隨著銅濃度的增加，腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達有了明顯的上調(diào)，而加入TM組腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達逐漸降低。這一結(jié)果與RIGIRACCIOLO等[22]的研究一致。

綜上所述，本實驗通過建立H22荷瘤小鼠模型，在銅和TM的作用下觀察腫瘤的生長情況。實驗結(jié)果表明，銅能夠促進腫瘤的生長，其機制可能是通過上調(diào)腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達，從而達到促進腫瘤細胞增殖的作用，但仍需要進一步的深入研究。本實驗結(jié)果為肝癌的預防提供了參考，同時也為防治銅污染提供了證據(jù)。

[參考文獻]

[1] 劉志輝,楊偉萍,韋長元,等. 微量元素鋅、銅、錳與硒在原發(fā)性肝癌組織和血清中的含量及相關(guān)性研究[J]. 廣西醫(yī)科大學學報, 2016,33(1):66-70.

[2] ARRUDA L F, ARRUDA S F, CAMPOS N A, et al. Dietary iron concentration may influence aging process by altering oxidative stress in tissues of adult rats[J]. Plos One, 2013,8(4):e61058.

[3] 韓盡斌,曲毅,徐新春,等.抗腫瘤銅配合物研究進展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志2014 (18):2034-2037.

[4] HAIQUAN L, DEBANGSHU S, LISHA X, et al. Chemotherapy triggers HIF-1-dependent glutathione synthesis and copper chelation that induces the breast cancer stem cell phenotype[J]. P Natl Acad Sci USA, 2015,112(33):4600-4609.

[5] STOCKAK, REUNER U, GOHILK, et al. Effects of copper toxicity on response inhibition processes: a study in Wilson’s disease[J]. Arch Toxicol, 2016,90(7):1623-1630.

[6] YOGANATHANS, SUDHAKARSV, ARUNACHALG, et al. Menkes disease and response to copper histidine: An Indian case series[J]. Ann Indian Acad Neur, 2017,20(1):62-68.

[7] SQUITTI R, VENTRIGLIA M, GENNARELLI M. Non-Ceruloplasmin Copper Distincts Subtypes in Alzheimer’s Disease: a Genetic Study of ATP7B Frequency[J]. MolNeurobiol, 2016,54(1):671-681.

[8] AVAN A, HOOGENRAAD T U. Zinc and Copper in Alzheimer’s Disease[J]. J Alzeimers Dis, 2015,46(1):89.

[9] DENOYER D,PEARSON H B,CLATWORTHY S A, et al. Copper as a target for prostate cancer therapeutics: coppe-rionophore pharmacology and altering systemic copper distribution[J]. Oncotarget, 2016,7(24):37064-37080.

[10] SETHURAMAN R. P0007 Estimation of serum iron and se-rum copper in oral precancer, cancer and healthy individuals: A comparative study-European Journal of Cancer[J]. Eur J Can-cer, 2014,50(4):e11.

[11] SOHRABIM, GHOLAMIA, AZAR M, et al. Trace element and heavy metal levels in colorectal cancer: comparison between cancerous and non-cancerous tissues[J]. Biol Trace Elem Res, 2017(22):1-8.

[12] JAMLOSM, ISMAILA, JAMLOSM. Hybrid graphene-copper UWB array sensor for brain tumor detection via scattering parameters in microwave detection system[J]. Applied Physics A, 2017,123(1):112-123.

[13] SINGH B P, DWIVEDI S, DHAKAD U, et al. Status and interrelationship of zinc, copper, iron, calcium and selenium in prostate cancer[J]. Indian J of Clinical Bioc, 2016,31(1):50-56.

[14] SHEN F, CAI W S, LI J L, et al. The association between serum levels of selenium, copper, and magnesium with thyroid cancer: A meta-analysis[J]. Biol Trace Elem Res, 2015,167(2):225-235.

[15] KHOSHDEL Z, NAGHIBALHOSSAINI F, ABDOLLAHI K, et al. Serum copper and zinc levels among iranian colorectal cancer patients[J]. Biol Trace Elem Res, 2016,170(2):294-299.

[16] ANTONIADESV, SIOGA A, DIETRICHCE, et al. Is copper chelation an effective anti-angiogenic strategy for cancer treatment[J]? Med Hypotheses, 2013,81(6):1159-1163.

[17] 劉軍. 微量元素銅和鋅在實驗性肝癌中的變化及意義[J]. 醫(yī)藥前沿, 2017,7(33):165-166.

[18] 熊珊珊,石英英,石漢平. 活性氧與腫瘤研究進展[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2014,21(13):1045-1048.

[19] ARAYA M, NUNEZ H, PAVEZ L, et al. Administration of high doses of copper to capuchin monkeys does not cause liver damage but induces transcriptional activation of hepatic proli-ferative responses[J]. J Nutr, 2012,142(2):233-237.

[20] 劉志輝,楊偉萍,韋長元,等. 微量元素鋅、銅、錳與硒在原發(fā)性肝癌組織和血清中的含量及相關(guān)性研究[J].

廣西醫(yī)科大學學報, 2016,33(1):66-70.

[21] FERNANDES A S, FLóRIDO A, SARAIVA N, et al. Role of the copper(Ⅱ) complex Cu [15] pyN5 in intracellular ROS and breast cancer cell motility and invasion[J]. Chem Biol Drug Des, 2015,86(4):578-588.

[22] RIGIRACCIOLO D C, SCARPELLI A, LAPPANO R, et al. Copper activates HIF-1α/GPER/VEGF signalling in cancer cells[J]. Oncotarget, 2015,6(33):34158-34177.

[23] ISHIDA S, ANDREUX P, POITRYYAMATE C, et al. Bioavailable copper modulates oxidative phosphorylation and growth of tumors[J]. P Natl Acad Sci USA, 2013,110(48):19507-19512.

[24] PAVELA M, UITTI J, PUKKALA E. Cancer incidence among copper smelting and nickel refining workers in Finland[J]. Am J Ind Med, 2017,60(1):87-95.

[25] WANG Z, HUANG P, JACOBSON O, et al. Biomineralization-Inspired Synthesis of Copper Sulfide-Ferritin Nanocages as Cancer Theranostics[J]. Acs Nano, 2016,10(3):3453-3460.

[26] LIU P, BROWN S, CHANNATHODIYIL P, et al. Reply: Cytotoxic effect of disulfiram/copper on human glioblastoma cell lines and ALDH-positive cancer-stem-like cells[J]. Brit J of Cancer, 2013,108(4):993-993.

[27] FERRARAN.Vascular Endothelial Growth Factor [J]. Eur J of Cancer, 2013,32(14):274-276.

[28] FARHAN M, KHAN H Y, OVES M, et al. Cancer therapy by catechins involves redox cycling of copper ions and generation of reactive oxygen species[J]. Toxins, 2016,8(2):37-39.