葛 婷，何曉杰，葉爾保勒，阿斯喀·夏熱甫漢，雷程紅*，王振寶,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；3.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧 835000)

蜜蜂美洲幼蟲腐臭病(American foulbrood of honeybees)是由幼蟲芽胞桿菌(Paenibacilluslarvae)引起的蜜蜂幼蟲和蛹的一種急性、毀滅性傳染病。該病只感染蜜蜂幼蟲[1]，患病蜜蜂幼蟲最初會(huì)在體色上有明顯變化，顏色由正常的珍珠白變?yōu)樽攸S色、褐色甚至黑褐色，房蓋由凸起變?yōu)榘枷?，且潮濕色暗，感染后期的蟲尸可被拉成2 cm～3 cm的細(xì)絲，伴有魚腥臭味，最后緊貼于巢房壁，呈黑褐色難以清除的鱗片狀物[2-4]。幼蟲芽胞桿菌產(chǎn)生的芽胞有7層結(jié)構(gòu)包圍，具有極強(qiáng)的生命力，能抵抗熱和化學(xué)物質(zhì)，在高溫干燥等惡劣環(huán)境下至少能存活35年。該病一旦發(fā)生，極易造成蜂群衰弱及蜂群死亡[5-6]。該病最初發(fā)生于英國，后來傳到歐美各國，現(xiàn)遍布全世界。中國是養(yǎng)蜂大國，也是最大的蜂產(chǎn)品生產(chǎn)和出口國，該病對我國養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展以及蜂產(chǎn)品質(zhì)量已造成嚴(yán)重影響[7]。

幼蟲芽胞桿菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶，研究表明，這些蛋白酶為含鋅的金屬蛋白酶(Paenibacilluslarvaemetalloproteases，PLMP)，參與幼蟲退化[8-11]。Karian A研究發(fā)現(xiàn)了完整的幼蟲芽胞桿菌金屬蛋白酶基因的開放閱讀框，并根據(jù)該閱讀框中完整的基因序列進(jìn)行了金屬蛋白酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建，獲得了重組蛋白及鼠抗金屬蛋白酶基因多克隆抗體[12]。本研究根據(jù)幼蟲芽胞桿菌PLMP基因序列，設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物，克隆PLMP基因。通過原核表達(dá)獲得PLMP重組蛋白，并用純化后的重組蛋白接種家兔，制備兔抗PLMP多克隆抗體，為進(jìn)一步研究幼蟲芽胞桿菌快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 幼蟲芽胞桿菌，E.coliBL21(DE3)及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1，由伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局保存。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 2 kg左右健康雄性新西蘭大白兔，購自伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀，電泳儀，紫外分光光度計(jì)，凝膠成像儀，溫箱，冰箱，離心機(jī)，微量振蕩器，微量移液器，金屬干浴鍋，超聲波破碎儀，恒溫?fù)u床，半干轉(zhuǎn)印槽，全功能微孔板檢測儀。

1.1.4 主要試劑 10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶，均購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒，購自Axgen公司；T載體，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；BamHⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶，購自New England Biolabs公司；質(zhì)粒提取試劑盒及T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，購自KPL公司；TMB底物溶液，購自康維世紀(jì)公司；DAB顯色液，購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 PLMP基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的幼蟲芽胞桿菌核苷酸序列(CP003355.1)，利用 Primer premier 5.0設(shè)計(jì)1對特異性引物(見表1)，引物的5′端分別加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)識別序列。將幼蟲芽胞桿菌陽性菌液DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 3 μL，MgCl22.5 μL，dNTPs 2.5 μL，Taq酶(5U)0.25 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；93℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。

表1 PCR擴(kuò)增PLMP基因所需的引物序列

1.2.2 原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PLMP的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與T載體連接(25℃ 15 min)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)液體無抗性LB培養(yǎng)基37℃、200 r/min搖菌復(fù)蘇。復(fù)蘇后4 000 r/min離心3 min～5 min，棄上清液，菌泥混勻后均勻涂于Amp+LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽性菌落后搖菌培養(yǎng)37℃ 12 h～16 h，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒和pGEX-4T-1分別用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用T4連接酶16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，按上述復(fù)蘇方法復(fù)蘇后均勻涂板于Amp+LB平板上，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽性菌落后，37℃、200 r/min搖菌培養(yǎng)過夜。菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，分析測序結(jié)果。

1.2.3 PLMP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化、純化1.2.3.1 最佳誘導(dǎo)濃度的確定 將300 μL重組菌pGEX-4T-1-PLMP接種至Amp+LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，搖菌條件下培養(yǎng)至OD600 nm值達(dá)到0.4～0.6之間，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG。在37℃、200 r/min搖菌誘導(dǎo)8 h，經(jīng)重組蛋白SDS-PAGE檢測，確定最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.3.2 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定 將300 μL重組菌pGEX-4T-1-PLMP接種至30 mL的Amp+LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振搖條件下培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6左右，加入0.8 mmol/L IPTG，分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7、8 h。經(jīng)重組蛋白SDS-PAGE檢測，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.3.3 重組蛋白SDS-PAGE的檢測 經(jīng)上述不同條件下誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-PLMP重組菌液，經(jīng)4℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用2 mL 1×PBS(pH7.4)混勻菌體沉淀，經(jīng)4℃、10 000 r/min離心10 min，吸棄上清液。重復(fù)該過程3次。在菌體沉淀中加入2 mL的PBS，置于冰上，超聲破碎8 min(超5 s停8 s)，4℃、1 000 r/min離心5 min。分離上清液與沉淀，沉淀用1 mL PBS重懸。分別取上清液與沉淀懸液各50 μL，加入等體積的2×SDS-PAGE，置沸水中10 min后經(jīng)10 000 r/min離心5 min。將上述煮沸處理好的上清液及沉淀懸液樣品，分別加樣至SDS-PAGE凝膠中，80 V電泳45 min左右，再改為120 V電泳40 min。電泳后的凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色10 min，再脫色。

1.2.3.4 重組蛋白的純化 采用切膠法純化。先將樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的凝膠，先用1×PBS反復(fù)清洗3次，再用-20℃預(yù)冷的0.25 mol/L KCl溶液染色2 min左右，最后用液氮冷凍，充分研磨。用適量PBS混勻粉末，再反復(fù)凍融3次，4℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清液即為純化后重組蛋白。

1.2.3.5 重組蛋白的定量 按照BSA試劑盒對純化后的蛋白進(jìn)行定量。將BSA試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)樣品，根據(jù)說明書方法，分別稀釋到2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 μg/mL。將純化后的蛋白與上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，重組蛋白的條帶與標(biāo)準(zhǔn)樣品條帶比對后即可得出重組蛋白含量，或用紫外分光光度計(jì)檢測純化后的蛋白濃度。

1.2.4 PLMP多克隆抗體的制備 取2 mg純化的PLMP蛋白(1 mg/mL)與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，將乳化好的混合液對新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射免疫。首免后15 d，取1 mg純化的PLMP蛋白(1 mg/mL)與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，將乳化好的混合液對兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫。此后每隔7 d用同量的乳化液對兔再免疫，共3次；最后一次免疫7 d后，頸動(dòng)脈采血，將血液37 ℃溫育2 h后4 ℃靜置過夜，然后4 000 r/min離心10 min，收集血清并分裝，于-20℃保存。

1.2.5 PLMP多克隆抗體效價(jià)的測定 用間接ELISA方法測定。用包被液稀釋PLMP重組蛋白至4 μg/mL，以100 μL/孔加入至酶標(biāo)板，設(shè)3個(gè)重復(fù)，4℃包被過夜。棄液，除凈殘液，每孔加入150 μL PBST洗液振蕩洗板3次，20 s/次，棄液拍干。每孔加入200 μL 50 g/L脫脂乳粉，37℃封閉1 h，用PBST洗板3次同上。用50 g/L脫脂乳稀釋待檢血清，稀釋8個(gè)梯度，稀釋度分別為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600。每個(gè)稀釋度酶標(biāo)板上每孔加入100 μL，同時(shí)設(shè)置陰性對照(免疫前血清)及空白對照，37℃溫育1 h，用PBST洗板3次同上。用PBST 1∶5 000倍稀釋HRP-山羊抗兔IgG，每孔加入100 μL，37℃溫育1 h，用PBST洗板3次同上。每孔加入100 μL的TMB顯色液，37℃避光顯色10 min后，每孔加入50 μL的終止液終止顯色，在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm值。效價(jià)判定：待檢血清(P)OD450/陰性血清(N)OD450>2.1，待檢血清最大稀釋倍數(shù)即為多抗效價(jià)。

1.2.6 PlMP多克隆抗體反應(yīng)性的檢測 用Western blot方法檢測。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，保留分離膠，剪取大小合適的NC膜；將PAGE膠、NC膜和兩片濾紙分開浸泡在轉(zhuǎn)印液中20 min；打開半干轉(zhuǎn)印槽，將濾紙-NC膜-凝膠-濾紙按從下到上順序放入轉(zhuǎn)印槽中央，輕趕氣泡，以15 V電壓，轉(zhuǎn)印45 min；取出NC膜，用PBST洗液洗3次，將NC膜置于50 g/L脫脂乳溶液中，4℃封閉過夜，PBST溶液40 r/min振蕩洗滌3次，每次6 min～8 min。用50 g/L脫脂乳1∶1 000稀釋兔抗PLMP多抗血清，將NC膜放入其中，37℃溫育NC膜 1 h，PBST振蕩洗膜3次。用PBST 1∶10 000稀釋HRP-山羊抗兔IgG，將NC膜放入其中，37℃溫育NC膜1 h，PBST振蕩洗膜3次。將NC膜置于現(xiàn)配的DAB顯色液中，出現(xiàn)目的條帶后，用蒸餾水終止顯色，拍照保存顯色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PLMP基因的擴(kuò)增和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PLMP的構(gòu)建

以蜜蜂幼蟲芽胞桿菌菌液為模板，利用合成的特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因，獲得與預(yù)期條帶大小一致約1 200 bp的核苷酸序列，見圖1所示。重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-PlMP菌液鑒定及雙酶切鑒定均獲得大小約為1 200 bp的擴(kuò)增片段(圖2和圖3)。重組陽性菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank(CP003355.1)公布的序列同源性達(dá)99%。說明已成功構(gòu)建pGEX-4T-1-PLMP基因原核表達(dá)載體。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.PLMP基因 PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of PLMP gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.pGEX-4T-1-PLMP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;2.pGEX-4T-1質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 5 000；1.pGEX-4T-1-PLMP digested byBamHI andEcoRI;2.pGEX-4T-1plasmid

圖2 pGEX-4T-1-PLMP雙酶切鑒定結(jié)果

Fig.2 Identification of pGEX-4T-1-PLMP by enzyme digestion

2.2 重組PLMP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化、純化及定量

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，獲得分子質(zhì)量大小約為70 ku的重組蛋白，與預(yù)期大小相同，表明幼蟲芽胞桿菌PLMP重組蛋白正確表達(dá)。根據(jù)SDS-PAGE條帶大小，確定IPTG終濃度為0.8 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的量最大且重組蛋白存于菌液沉淀中(圖4)。重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)5 h時(shí)表達(dá)的量最大，結(jié)果見圖5所示。在最佳條件下誘導(dǎo)出的PLMP重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE切膠法純化，用BSA標(biāo)準(zhǔn)樣品SDS-PAGE法及紫外分光光度計(jì)法測定純化蛋白濃度均為1.0 mg/mL(圖6和圖7)。

2.3 PLMP多克隆抗體效價(jià)的測定

用間接ELISA測定抗幼蟲芽胞桿菌PLMP多克隆抗體效價(jià)為1∶12 800(圖8)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2.pGEX-4T-1-PLMP PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control;2.PCR products of pGEX-4T-1-PLMP

圖3 pGEX-4T-1-PLMP PCR鑒定結(jié)果

Fig.3 Identification of pGEX-4T-1-PLMP by PCR

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pGEX-4T-1-PLMP轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)的上清液；2～6.37℃下pGEX-4T-1-PLMP轉(zhuǎn)化菌IPTG終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的上清液；7.pGEX-4T-1-PLMP轉(zhuǎn)化菌未誘導(dǎo)的沉淀；8～12.37℃下pGEX-4T-1-PLMP轉(zhuǎn)化菌IPTG終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的沉淀

M.Portein molecular weight Marker;1.The supernatant of non-inducted pGEX-4T-1-PLMP;2-6.The supernatants of inducted pGEX-4T-1-PLMP with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG for 8 h at 37℃;7.The precipitate of non-inducted pGEX-4T-1-PLMP; 8-12.The precipitates of inducted pGEX-4T-1-PLMP with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/LIPTG for 8 h at 37℃

圖4不同濃度IPTG對幼蟲芽胞桿菌PLMP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.4 Effects of different IPTG concentrations on expression ofPaenibacilluslarvaePLMP recombinant proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9.37℃下0.8 mmol/LIPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1-PLMP時(shí)間為0、1、2、3、4、5、6、7、8 h

M.Portein molecular weight Marker;1-9.Inducted pGEX-4T-1-PLMP with 0.8 mmol/L IPTG at 37℃ for 0，1，2，3，4，5，6，7，8 h

圖5誘導(dǎo)時(shí)間對幼蟲芽胞桿菌PLMP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.5 Effects of induction time on expression ofPaenibacilluslarvaePLMP recombinant proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7.BSA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 μg/mL；8.純化后的PLMP重組蛋白

M Portein molecular weight Marker;1-7.The concentrations of BSA standard with 2 000,1 500,1 000,750,500,250,100 μg/mL;8.The purified PLMP recombinant protein

圖6 PLMP重組蛋白的純化及定量

Fig.6 Purification and quantification of PLMP recombinant protein

2.4 PLMP多克隆抗體反應(yīng)性的測定

以PLMP重組蛋白為抗原，以1∶1 000稀釋兔抗血清為一抗，Western blot檢測抗原與抗體特異性結(jié)合，DAB顯色后出現(xiàn)條帶(圖9)。

3 討論

目前，針對蜜蜂幼蟲芽胞桿菌的檢測多采用PCR檢測技術(shù)。Govan V A等[13]根據(jù)幼蟲芽胞桿菌16SrRNA編碼基因片段設(shè)計(jì)的引物特異性較強(qiáng)。此后設(shè)計(jì)的1對引物KAT1和KAT2，該引物特異性強(qiáng)并且可以鑒別出幼蟲芽胞桿菌的不同亞種[14]。通過對這些PCR技術(shù)的改進(jìn)及引物的改良，何曉杰等[15]建立的二溫式PCR方法將退火和延伸溫度合二為一，結(jié)果顯示其檢測幼蟲芽胞桿菌的DNA靈敏度達(dá)33 fg/μL，且重復(fù)性良好。雖然PCR檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度較高，但是需要特殊儀器設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)操作條件較嚴(yán)格，并不利于基層及現(xiàn)場快速檢測，所以建立對幼蟲芽胞快速檢測的方法顯得十分必要。

圖7 紫外分光光度計(jì)測定純化后的PLMP重組蛋白濃度

圖8 抗幼蟲芽胞桿菌PLMP多克隆抗體血清效價(jià)

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.幼蟲芽胞桿菌PLMP重組蛋白；2.陰性對照

M.Portein molecular weight Marker;1.Recombinant protein ofPaenibacilluslarvaePLMP 2.Negative control

圖9抗幼蟲芽胞桿菌PLMP多克隆抗體反應(yīng)性

Fig.9 Reactivity of polyclonal antibodies againstPaenibacilluslarvaePLMP

本研究根據(jù)一段完整的基因序列，利用原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1在E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中成功表達(dá)了幼蟲芽胞桿菌金屬蛋白酶PLMP基因蛋白，對pGEX-4T-1-PLMP重組蛋白進(jìn)行表達(dá)形式分析，結(jié)果顯示重組蛋白存在于重組菌液沉淀中，其分子質(zhì)量大小約為70 ku。

試驗(yàn)證明，變性的蛋白質(zhì)抗原只要具備一級結(jié)構(gòu)，免疫動(dòng)物后也可產(chǎn)生抗體[16]。本研究對制備的PLMP重組蛋白采用切膠法純化，該純化方法能夠較好地提高重組蛋白的免疫純度和免疫效果[17]。將純化的PLMP重組蛋白與弗氏佐劑混合后免疫家兔，成功獲得兔抗PLMP多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA檢測，多抗效價(jià)較高，經(jīng)Western Blot方法測定，該多抗具有較好的反應(yīng)性。

高效價(jià)的抗體是研究建立免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)條件之一。多克隆抗體由于制備簡單，且能與多個(gè)抗原表位結(jié)合，在免疫學(xué)上應(yīng)用廣泛[18-19]。本研究所制備的多克隆抗體具有較好的反應(yīng)性，這為建立檢測PLMP蛋白的雙抗夾心ELISA方法提供了條件，本研究制備的PLMP重組蛋白和高效價(jià)多抗也為幼蟲芽胞桿菌膠體金快速檢測試紙條方法的建立奠定了基礎(chǔ)，PLMP重組蛋白為制備PLMP單克隆抗體提供了較好的抗原。

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