王麗紅，王 妍，張傳美，韓先杰，楊海燕，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

1 病例基本情況

山東省青島市某規(guī)?；i場(chǎng)存欄母豬3 300頭左右。2018年3月，該豬場(chǎng)仔豬連續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，半個(gè)月來(lái)每天死亡一二百頭，七八十日齡發(fā)病仔豬表現(xiàn)為發(fā)熱、喘氣、關(guān)節(jié)腫大，三四十日齡發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為水樣腹瀉。發(fā)病半個(gè)月后，該場(chǎng)送檢4頭病豬（樣本1、2為三四十日齡的發(fā)病仔豬，樣本3、4為七八十日齡的發(fā)病仔豬）到青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行診斷。該場(chǎng)發(fā)病仔豬已免疫接種支原體、圓環(huán)病毒，以及豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病和口蹄疫等疫苗。

2 臨床癥狀和病理剖檢變化

發(fā)病仔豬皮膚蒼白，腹股溝肛門(mén)處有出血點(diǎn)。剖檢發(fā)現(xiàn)：心包內(nèi)有滲出液，絨毛心；肺臟有出血點(diǎn)，纖維素性滲出，有實(shí)變；淋巴結(jié)腫大；腹腔內(nèi)有大量纖維素性滲出；脾臟邊緣梗死，有出血點(diǎn)；腎臟有針尖狀出血點(diǎn)（皮質(zhì)部髓質(zhì)部均有）；關(guān)節(jié)腔有滲出，關(guān)節(jié)處水腫（圖1）。

圖1 病理剖檢情況

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌檢測(cè)

3.1.1 細(xì)菌分離與形態(tài)觀察 無(wú)菌取病死豬關(guān)節(jié)膿汁、心包積液及細(xì)支氣管分泌物，劃線(xiàn)接種于綿羊鮮血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，綿羊鮮血瓊脂平板上長(zhǎng)出兩種菌落：一種是針尖大小、灰白色、半透明、邊緣整齊的小菌落，呈β型溶血，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌，多呈單個(gè)雙球型或短鏈狀排列；另一種是米粒大小、白色、不溶血的菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，“V”型排列。

3.1.2 16S rRNA基因的PCR檢測(cè)及測(cè)序分析兩種分離菌16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小約1 600 bp，與預(yù)期大小相符的目的條帶（圖2）。利用NCBI的BLAST，將兩種分離菌16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)一株分離菌與豬鏈球菌序列（CP024126.1）同源性為99%，另一株分離菌與支氣管敗血波氏桿菌序列（AP014582.1）同源性為99%，因此懷疑存在豬鏈球菌和支氣管敗血波氏桿菌的混合感染。

3.2 病毒檢測(cè)

無(wú)菌采集病豬的肺臟、脾臟、小腸和淋巴結(jié)等組織，研磨后通過(guò)試劑盒提取病毒核酸，使用熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自青島巴特菲生物科技有限公司）檢測(cè)豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病病毒（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）。結(jié)果顯示，送檢的4個(gè)樣本均為PRRSV陽(yáng)性，樣本2為PCV2陽(yáng)性，樣本1、2為PEDV陽(yáng)性（表1）。

圖2 兩種分離菌16S 的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

4 討論

本研究通過(guò)對(duì)病例的流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及病理分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室病原鑒定，對(duì)該病進(jìn)行了確診，對(duì)下一步豬場(chǎng)的治療及防控提供了依據(jù)。

豬繁殖與呼吸綜合征由于其具有高流行性以及高度致死性等特點(diǎn)，目前已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一。對(duì)于大多數(shù)豬場(chǎng)來(lái)說(shuō)，疫苗免疫仍然是防控該病的重要手段，但如果免疫方法和程序不合理，豬群的抗體水平不達(dá)標(biāo)，就很有可能會(huì)暴發(fā)疾病。該豬場(chǎng)恰逢仔豬斷奶和轉(zhuǎn)群，造成應(yīng)激，導(dǎo)致了疾病暴發(fā)。有研究表明，豬感染PRRSV后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬功能以及免疫細(xì)胞數(shù)量大幅度下降，導(dǎo)致機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫功能大大降低，從而為其他病原體的入侵開(kāi)辟了通道[1-3]。目前，PCV2也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。眾多研究者對(duì)PCV2致病機(jī)理做了大量研究，大多數(shù)研究證明PCV2可導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。至今，由于PCV2的廣泛分布，以及PCV2對(duì)環(huán)境超強(qiáng)的抵抗力，采用有效的防控措施尤為重要[4-5]。豬流行性腹瀉是由PEDV引起的具有毀滅性的一種高度接觸性豬腸道傳染病，臨床上主要以食欲下降、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水，最后酸中毒為基本特征，各年齡階段的豬都易感染，尤其以哺乳仔豬最為嚴(yán)重，通常死亡率可達(dá)到100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。

最新流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、PRV、 PRRSV、CSFV、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、放線(xiàn)桿菌胸膜肺炎、肺炎支原體和支氣管敗血波氏桿菌等病原體常常發(fā)生混合感染，導(dǎo)致豬群病死率上升[8]。因此，在多重混合感染的形勢(shì)下，單純依賴(lài)疫苗免疫防控是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，采取科學(xué)有效的綜合防控措施更為重要。目前，防控各種病毒病主要依靠合理的疫苗免疫，以及健全的生物安全措施。除此之外，還非常有必要定期監(jiān)測(cè)豬群病毒病抗體水平。臨床中，常由于疫苗免疫操作不規(guī)范、免疫劑量不足或存在其他免疫抑制性疾病等原因造成免疫后疾病暴發(fā)[9]，因此應(yīng)隨時(shí)掌握抗體消長(zhǎng)規(guī)律，為豬場(chǎng)制定更加合理的免疫程序提供參考。

5 結(jié)論

本研究對(duì)山東省某規(guī)模豬場(chǎng)發(fā)生的仔豬死亡疫情進(jìn)行了臨床診斷，結(jié)合仔豬發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，最終確診為PRRSV、PEDV、PCV2的混合感染，同時(shí)疑似存在豬鏈球菌和支氣管敗血波氏桿菌的感染。當(dāng)前，豬群的病毒、細(xì)菌混合感染較為普遍，單純依賴(lài)疫苗免疫防控遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要采取科學(xué)有效的綜合防控措施，定期監(jiān)測(cè)豬群疫病的抗體水平，及時(shí)調(diào)整免疫程序，防止疫病暴發(fā)。

[1] LABARQUE G，REETH KV，NAUWYNCK H，et al.Impact of genetic diversity of European-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains on vaccine efficacy[J].Vaccine，2004，22（31/32）：4183-4190.

[2] 謝印乾，沈志強(qiáng)，王桂花等. 豬繁殖與呼吸綜合征免疫學(xué)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（6）：6-10.

[3] 董雅琴，劉林青，李艷，等. 一起豬藍(lán)耳病與偽狂犬病混合感染的緊急流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2018，35（4）：12-16.

[4] 孫光野，張洪友. 豬高致病性藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病和鏈球菌病混合感染的診斷[J]. 豬業(yè)科學(xué)，2017（2）：129.

[5] 曹勝波，陳煥春，肖少波，等. 豬環(huán)狀病毒2型的PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（1）：53-56.

[6] 姜艷平. 豬流行性腹瀉病毒S基因片段的原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，39（7）：602-607.

[7] 張志，董雅琴，劉爽，等. 我國(guó)部分省份豬流行性腹瀉的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2014，31（10）：47-51.

[8] 王洪光，湯德元，曹智勇，等. 規(guī)?；i場(chǎng)主要細(xì)菌性疫病的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2014，46（9）：98-100.

[9] CHEN J，LIU X，SHI D，et al. Detection and molecular diversity of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus in China[J].Viruses，2013，5（10）：2601-2613.