錢曉宇，王占飛，繩秀珍，唐小千，邢 婧，戰(zhàn)文斌

（中國海洋大學水產動物病害與免疫學實驗室，山東青島 266003）

魚類的黏膜免疫系統(tǒng)相對于陸生動物具有更重要的作用，受到的關注越來越多[1-2]。在高等脊椎動物的黏膜免疫中，多聚免疫球蛋白受體（pIgR）能夠介導分泌型免疫球蛋白通過轉胞吞作用運輸到黏膜表面，發(fā)揮中和及免疫清除病原的功能，也可以獨自在體表黏液中發(fā)揮非特異性免疫功能[3]。硬骨魚pIgR在結構和功能上與哺乳動物有很多相似之處[4]，也具有轉運黏膜Igs的功能[5-6]，可以在體外結合多種細菌[7]，發(fā)揮免疫防御作用。研究發(fā)現多種魚類在免疫或感染后pIgR表達量顯著上調[8-11]，表明在病原刺激下硬骨魚pIgR應答表達變化趨勢與高等動物相似[12]。對哺乳動物的研究表明，IFN-γ、IL-1β和 TNF-α可以調節(jié) pIgR 轉錄[13-14]。其中：IFN-γ可以通過上皮細胞上的受體，激活細胞內的信號傳導及轉錄激活因子1（STAT1）。STAT1與干擾素調節(jié)因子（IRF）上的相應位點結合引發(fā)IRF轉錄和表達。IRF進入細胞核與PIGR基因1號外顯子上的相應位點結合引發(fā)pIgR的轉錄[14-15]；IL-1可以活化一個MyD88依賴性信號通路，經NF-κB途徑調節(jié)pIgR的轉錄[15]；TNF-α可以通過上皮細胞膜上的受體，激活細胞內NF-κB通路，進而引發(fā)pIgR的轉錄和表達[16]。鑒于硬骨魚pIgR在結構與功能上與高等脊椎動物的相似性，因而推斷在哺乳動物pIgR調控過程中起作用的細胞因子也能調控硬骨魚pIgR的表達，但是目前還缺乏相關研究資料。

本研究用滅活鰻弧菌（Vibrio anguillarum）浸泡和注射兩種免疫方式免疫牙鲆（Paralichthys olivaceus），采用實時熒光定量PCR（qPCR），分析各組織中細胞因子IFN-γ、IL-1β和TNF-α表達量的動態(tài)變化，以期為研究魚類細胞因子IFN-γ、IL-1β和TNF-α對pIgR的表達調控提供資料。

1 材料與方法

1.1 疫苗制備

將實驗室保藏的鰻弧菌，經連續(xù)劃線法在BHI固體培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)24 h；挑取單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃擴大培養(yǎng)24 h；菌液經8 000 ×g離心10 min后回收菌體，再用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）洗滌3次；在終濃度為0.5%福爾馬林中，室溫放置24 h滅活，隨后離心回收菌體；清洗3次后，取200 μL涂板驗證是否完全滅活；將完全滅活的細菌放到4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫和樣品采集

將健康牙鲆在實驗室暫養(yǎng)1周，使其適應環(huán)境。期間連續(xù)曝氣，保持合適水溫，每天換水1/3。適應環(huán)境后，將牙鲆隨機分成4組用于免疫：第1組腹腔注射濃度為1×108CFU/mL的鰻弧菌滅活疫苗（PBS稀釋），每尾100 μL；第2組每尾腹腔注射100 μL PBS作為注射組對照；第3組在用海水稀釋的濃度為1×108CFU/mL的滅活菌液中連續(xù)充氣浸泡30 min；第4組在含有100 μL PBS的海水中浸泡30 min，作為浸泡組對照。

4組魚分別于免疫前，以及免疫后的4、8、12、24、48、72、96 h取樣。每組隨機取魚3尾，解剖取皮膚、鰓、前腸、中腸、后腸、肝、脾和頭腎8種組織；分別混合3尾魚的各組織，提取總RNA，反轉錄得到cDNA模板；測定cDNA濃度并將其調整一致，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光定量PCR引物設計

根據NCBI中公布的牙鲆腫瘤壞死因子（TNF-α）、干擾素（IFN-γ）、白介素（IL-1β）及核糖體RNA（18S RNA）基因序列（表1），利用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物；先在普通PCR儀上擴增，再通過瓊脂糖電泳檢測PCR產物。電泳條帶單一表明引物特異性高，可作為熒光定量PCR引物。

1.4 熒光定量PCR及數據分析

以反轉錄得到的cDNA為模板，18S rRNA為內參，進行實時熒光定量PCR檢測。使用SYBR Green I Master mix試劑盒在熒光定量PCR儀上擴增，所得Ct值利用2-△△Ct法計算免疫后不同時間點組織中的細胞因子（TNF-α、IL-1β、IFN-γ） 表 達 量。 利 用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差（one-way ANOVA）分析基因表達量差異（顯著性水平為0.05）。

2 結果

2.1 免疫前后IL-1β變化

免疫前及免疫后96 h內，試驗組牙鲆皮膚、鰓、前腸、中腸、后腸、肝臟、脾和頭腎中的IL-1β表達量呈現先上升后下降趨勢（圖1-A—圖1-H）；除注射組牙鲆皮膚中IL-1β上調速度稍慢外（圖1-A），其他組在4—72 h之間顯著高于對照組水平。在黏膜免疫組織皮膚和鰓中，浸泡組IL-1β表達量在免疫后12 h達到峰值，注射組在24 h達到峰值，浸泡組峰值（比對照組高12倍和9倍）高于注射組（比對照組高9倍和6倍）（圖1-A，圖1-B）；而在系統(tǒng)免疫組織脾和頭腎中的情況則相反，注射組IL-1β表達量在12 h達到峰值（上調50～60倍）， 而浸泡組在24 h達到峰值（上調10倍左右）（圖1-G，圖1-H）；其他組織中，兩種免疫處理組的IL-1β表達量同時達到峰值，但注射組高于浸泡組（圖1-C—圖1-F）。

表1 牙鲆細胞因子表達分析所用引物

圖1 鰻弧菌滅活疫苗免疫前后牙鲆各組織中IL-1β表達量的變化

2.2 免疫前后IFN-γ變化

在免疫后96 h內，IFN-γ基因變化量也呈現出先上升后下降趨勢，且在免疫后4～72 h期間，免疫組顯著高于對照組（圖2-A—圖2-H）。在浸泡組皮膚、鰓以及注射組鰓、肝臟和脾臟中，IFN-γ表達量在免疫后12 h達到峰值（圖2-A，圖2- B，圖2-F，圖2-G），其余組織中的IFN-γ表達量皆在24 h達到峰值（圖2-C—圖2-E，圖2-H）。浸泡免疫組皮膚、鰓和肝臟中的IFN-γ應答較強，達到對照組的15～20倍（圖2-A，圖2-B，圖2-F）；注射組頭腎和脾臟中的IFN-γ表達量是對照組的30倍左右（圖2-G，圖2-H）。但是，兩種免疫方式在腸道中引起的IFN-γ表達量只有對照組的6～8倍（圖2-C—圖2-E）。

2.3 免疫前后TNF-α變化

圖2 鰻弧菌滅活疫苗免疫前后牙鲆各組織中IFN-γ表達量的變化

免疫后牙鲆各組織內的TNF-α基因變化同樣呈現先上升后下降趨勢（圖3-A—圖3-H）。浸泡組皮膚和頭腎中的TNF-α表達量在4 h后開始顯著高于對照組（圖3-A—圖3-H），皮膚中的12 h時達到峰值（圖3-A），其他組織均從8 h后開始顯著上升（圖3-B—圖3-E，圖3-G）。如：肝臟中的TNF-α表達量12 h后才顯著高于對照組（圖3-F），48 h時達到峰值（圖3-F），其他組織中的皆在24 h時達到峰值。注射組脾和頭腎中的TNF-α表達量4 h后開始顯著上升（圖3-G，圖3-H），其他組織均在8 h后開始顯著高于對照組（圖3-A—圖3-F）。兩種免疫方式引起的TNF-α應答變化相差不大，皆比對照組高2～4倍，但在皮膚和鰓中，浸泡組的TNF-α表達量高于注射組，其他組織則相反。

圖3 鰻弧菌滅活疫苗免疫前后牙鲆各組織中TNF-α表達量的變化

3 討論

本研究結果顯示，鰻弧菌注射和浸泡免疫后，牙鲆各組織中的IL-1β、TNF-α和IFN-γ基因表達量相對于對照組都有顯著增加，說明兩種方式都能有效引起牙鲆3種細胞因子的免疫應答。其中，在皮膚和鰓中，浸泡方式引起的3種細胞因子免疫應答均比注射組啟動早，且峰值高于注射組。這可能是由于鰓和皮膚直接暴露于水中，浸泡免疫方式可以直接且快速刺激這兩個部位在短時間內產生局部免疫應答。相反，在頭腎和脾臟中，注射免疫引起的IL-1β、TNF-α和IFN-γ基因應答啟動較早，且峰值遠高于浸泡組，原因可能是浸泡法無法直接刺激脾臟和頭腎，因此產生的應答要晚于注射組。這與宋曉青等[17]的研究結果相似。在前、中、后腸以及肝臟中，注射組引起的IL-1β和TNF-α變化要稍早于浸泡組，而在中腸和肝臟中，浸泡組引起的IFN-γ上升速度和峰值都高于注射組。

IL-1β是IL-1家族中的一員，其本身并不具有生物學活性，需要與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）結合，加工成熟后才具有活性并參與到免疫調節(jié)中[18]。IL-1β可由單核細胞、巨噬細胞、樹狀細胞等產生，而細胞因子和微生物產物等很多物質都可以引起IL-1β基因的大量表達。IL-1β是炎癥反應中的重要因子，常被當作免疫刺激發(fā)生的陽性標志[19]。目前對魚類IL-1β的研究表明，在LPS刺激下，體外培養(yǎng)的虹鱒白細胞中，IL-1β表達量顯著升高[20]。LPS還可在體外誘導鯉魚頭腎白細胞[21]，以及鱸頭腎、鰓白細胞[22]增強IL-1β的表達。本研究發(fā)現在浸泡和腹腔注射滅活鰻弧菌后，牙鲆各組織內IL-1β表達相對于對照組都顯著上調，與石斑魚[23]、半滑舌蹋[24]以及大西洋鮭[25]中的研究結果一致。Hayashi等[26]發(fā)現IL-1β可以在體外刺激HT-29細胞系中pIgR陽性細胞的增殖并上調pIgR表達，而IL-1β也可以上調兔淚腺腺泡和上皮細胞中的pIgR表達[27-28]，IL-1β和IFN-γ在HT-29細胞系上對pIgR的表達調節(jié)表現出協同作用[29]。因此，本研究中IL-1β的上調表達可能是浸泡和腹腔注射滅活鰻弧菌后pIgR顯著上調表達的原因之一，但還有待于進一步研究。

IFN-γ是生物體內重要的免疫調節(jié)因子，具有廣譜抗病毒功能，可以通過促進MHCⅠ類及Ⅱ類抗原的加工提呈，促使CD4+B細胞向TH1細胞分化等過程，來實現對生物體免疫功能的調節(jié)。研究證明，重組的干擾素可以刺激HT-29細胞產生更多的pIgR[30-33]。本研究發(fā)現，經浸泡和注射免疫后，牙鲆各組織IFN-γ表達量顯著上升，變化趨勢與注射減毒愛德華氏菌后斑馬魚脾臟中IFN-γ的變化趨勢一致[34]，但IFN-γ調節(jié)魚類pIgR表達的直接證據還有待于通過阻斷劑阻斷IFN-γ表達[31]等手段抑制pIgR表達來證明。

TNF-α由活化的單核細胞、巨噬細胞和T細胞分泌，因可以在體內抑制并殺傷腫瘤細胞而得名。除了能使腫瘤細胞發(fā)生出血性壞死外，TNF-α還可以參與機體炎性反應和免疫應答的調節(jié)，具有促進細胞生長、分化、凋亡等重要作用[35]。本研究中，浸泡和注射免疫滅活鰻弧菌都引起了牙鲆各組織TNF-α上調表達，但是TNF-α的變化幅度比IL-1β和IFN-γ要小，這可能與TNF-α自身的特性有關。因為TNF-α表達量過高也會破壞機體的穩(wěn)態(tài)，造成病理損傷[36]。體外試驗證明，在急性和長期暴露于TNF-α條件下，HT-29細胞中的pIgR均會發(fā)生上調表達[37-39]。因此，本研究的TNF-α表達動態(tài)結果為深入研究TNF-α對pIgR的調控提供了資料。

本研究發(fā)現，鰻弧菌免疫后，IL-1β、IFN-γ和TNF-α等細胞因子的表達顯著上調，因此在硬骨魚中 IL-1β、IFN-γ和 TNF-α 3 種因子都可能具有調節(jié)pIgR表達的作用。滅活鰻弧菌免疫誘導這些細胞因子上調，進而通過IL-1β、IFN-γ和TNF-α相關的STAT1[14]或NF-κB[15-16]等途徑，促使牙鲆體內pIgR發(fā)生上調表達，但是牙鲆體內細胞因子與pIgR變化之間的關系，以及這3種細胞因子對魚類pIgR表達的調控機制還有待研究。

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