1，25(OH)2D3對脂多糖誘導下腎小管上皮細胞增殖與凋亡的影響

史欣輝 陳建平 楊 陽 李 銘 楊曉萍

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內科，新疆 石河子 832000)

慢性腎臟病(CKD)在全球的發(fā)病率逐年升高〔1，2〕。在我國，CKD的知曉率、治療率、控制率仍不容樂觀，隨著病情的進展，最終將導致終末期腎臟病，該病花費高，預后差。CKD的發(fā)病機制復雜，起病隱蔽，防治困難，因此，從CKD的發(fā)病機制出發(fā)尋找一種確實有效的方法具有重要意義〔3〕?；钚跃S生素D3是一種類固醇激素，其在體內的活性形式為1，25(OH)2D3，其經(jīng)典的生理作用為調節(jié)鈣磷代謝。1，25(OH)2D3可以抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡〔4〕，抑制炎癥反應〔5〕，同時其還能延緩大動脈重構與硬化〔6〕，保護血管內皮功能〔7,8〕。本研究旨在探討1，25(OH)2D3對脂多糖誘導下人腎小管上皮細胞(HK-2)細胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HK-2細胞株購于湘雅醫(yī)學院中心實驗室，保持了正常的形態(tài)與功能。低糖細胞培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶、細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8檢測試劑盒、碘化丙啶(均為美國Sigma產(chǎn)品)、無支原體胎牛血清(杭州四季青產(chǎn)品)、AnnexinV-FITC凋亡試劑盒(美國 Invitrogen產(chǎn)品)。

1.2細胞培養(yǎng)與實驗分組 HK-2 細胞進行傳代培養(yǎng)，當生長至 80%～90%融合后，用無血清低糖DMEM培養(yǎng)液同步化24 h，分為正常對照組(加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液)、脂多糖組(正常對照基礎上，加入脂多糖，使其終濃度為1 μg/ml)、1，25(OH)2D3〔正常對照基礎上，加入1，25(OH)2D3，使其終濃度為10-8mol/L〕、脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組〔先在正常對照基礎上加入脂多糖，使其終濃度為1 μg/ml，干預培養(yǎng)4 h，然后在正常對照基礎上加入1，25(OH)2D3，使其終濃度為10-8mol/L〕，均干預培養(yǎng)48 h。

1.3HK-2細胞增殖檢測 細胞以2×105個/ml接種于96孔板內，200 μl/孔，干預培養(yǎng)48 h后嚴格按照CCK-8細胞增殖檢測試劑盒操作，用酶標儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值(A450 nm)，每個實驗組設4個復孔，實驗重復3次，并按以下公式計算細胞抑制率(IR)=(A對照組值-A實驗組值)/(A對照組值)。

1.4HK-2細胞周期分布檢測 細胞以5×105個/ml接種于6孔板內，2 ml/孔，干預培養(yǎng)48 h后，流式細胞儀檢測細胞周期，并按以下公式計算細胞增殖指數(shù)(PI)=S期和G2期細胞比例之和/G1期、S期和G2期細胞比例之和。

1.5HK-2細胞凋亡檢測 細胞以5×105個/ml接種于6孔板內，2 ml/孔，按照實驗分組干預48 h后，嚴格按照AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡試劑盒操作步驟，用流式細胞儀檢測HK-2細胞的凋亡，實驗重復3次。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、LSD-t法和秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組HK-2細胞增殖比較 與正常對照組比較，脂多糖組HK-2細胞吸光度值明顯升高，細胞增殖明顯增加(P<0.01)；1，25(OH)2D3組HK-2細胞吸光度值明顯降低，細胞增殖明顯抑制(P<0.01)。與脂多糖組比較，脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組HK-2細胞吸光度值明顯降低，細胞增殖明顯抑制(P<0.01)。見表1。

表1 各組HK-2細胞增殖情況比較

1)與正常對照組比較；2)與脂多糖組比較:均P<0.01；下表同

2.2各組HK-2細胞周期分布比較 與正常對照組比較，脂多糖組HK-2細胞G0/G1期比例明顯降低，S期及G2/M期比例明顯增加，增殖指數(shù)明顯升高(均P<0.01)；1，25(OH)2D3組HK-2細胞G0/G1期比例明顯升高，S期及G2/M期比例明顯降低，增殖指數(shù)明顯降低(均P<0.01)。與脂多糖組比較，脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組HK-2細胞G0/G1期比例明顯升高，S期及G2/M期比例明顯降低，增殖指數(shù)明顯降低(均P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 各組HK-2細胞細胞周期分布比較

表2 各組HK-2細胞細胞周期分布及細胞凋亡率比較(%)

2.3各組人腎小管上皮細胞細胞凋亡比較 細胞凋亡率低，其凋亡率為(2.72±0.46)%。與正常對照組比較，脂多糖組HK-2細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；1，25(OH)2D3組HK-2細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。與脂多糖組比較，脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組HK-2細胞凋亡亦明顯增加(P<0.01)。見表2與圖2。

圖2 各組HK-2細胞凋亡率比較

3 討 論

目前，對于CKD的發(fā)病機制仍無統(tǒng)一認識。腎小管上皮細胞轉分化是各種腎臟疾病進展到終末期腎病的主要病理基礎，也是腎小管間質纖維化發(fā)生過程中的關鍵環(huán)節(jié)。因此，尋找能夠逆轉腎小管上皮細胞轉分化的因子或藥物，對于臨床上防治CKD，改善CKD預后具有重要意義〔9〕。1，25(OH)2D3經(jīng)典的生理作用為調節(jié)鈣磷代謝。1，25(OH)2D3可抑制腎臟細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡，進而發(fā)揮其腎臟保護作用〔10～13〕。本文提示脂多糖能顯著促進HK-2細胞的增殖。1，25(OH)2D3能顯著抑制HK-2細胞的增殖，1，25(OH)2D3可能通過某種機制逆轉脂多糖對HK-2細胞的促增殖作用。細胞增殖的過程，其本質是DNA復制的過程。本文結果說明脂多糖能夠顯著促進HK-2細胞等增殖。1，25(OH)2D3能夠顯著抑制HK-2細胞的增殖。1，25(OH)2D3可能通過某種機制逆轉脂多糖對HK-2細胞的促增殖作用。

正常情況下，細胞的增殖與細胞凋亡處于動態(tài)平衡〔14〕，當細胞受外界細胞因子或炎癥因子的作用，細胞的這種平衡將被打破，進而導致疾病的發(fā)生。在腎臟疾病炎癥的修復過程中可以通過細胞凋亡來消除過度增殖的細胞〔15〕。本文結果說明脂多糖可顯著抑制HK-2細胞凋亡。1，25(OH)2D3能夠顯著促進HK-2細胞的凋亡。1，25(OH)2D3可能通過某種機制逆轉脂多糖對HK-2細胞凋亡的抑制作用。

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