宋艷麗，高小麗，張 鋆，趙 濤，黃貴斌，王睿豪，梁雞保(.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 700;.神木縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西神木 79300)

小粒黑豆是豆科植物大豆[Glycinemax(L.)merr]的黑色種子，因其含有豐富的不飽和脂肪酸、氨基酸、黃酮、酚類物質(zhì)、花色苷等[1-3]，具有護(hù)心保肝、抗癌抗衰、減肥益智等多種保健功效，是極具開發(fā)潛力的藥食兼用植物資源[4-10]。小粒黑豆是中國黃土高原地區(qū)的主栽品種，在當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展中占據(jù)重要地位[11]。近年來，黑色食品的保健功效受到廣泛關(guān)注，而黑豆作為主要的黑色食品也備受關(guān)注。面對(duì)市場需求的多樣性，生產(chǎn)滿足需求的高品質(zhì)黑豆成為發(fā)展黃土高原農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵，因此對(duì)小粒黑豆種質(zhì)資源的鑒選利用和優(yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)的研究具有重要意義。

黃酮類化合物的合成主要通過苯丙烷途徑，通過不同的前體物質(zhì)在有關(guān)酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)或酪氨酸解氨酶(TAL)的作用下合成[12]。N、P礦質(zhì)營養(yǎng)可以通過影響黃酮類物質(zhì)合成途徑有關(guān)酶的活性從而促進(jìn)或抑制其合成[13]。黃酮、酚類物質(zhì)及花色苷等是重要的抗氧化活性物質(zhì)，能夠與自由基反應(yīng)清除自由基從而消除氧化作用，因此其含量的多少?zèng)Q定抗氧化能力的強(qiáng)弱[14-18]。李娟等[14]的研究表明，N營養(yǎng)能夠調(diào)控青花菜中酚類物質(zhì)的合成。劉偉[19]的研究表明，缺N、缺P均可通過影響酶的活性從而影響菊花中某些黃酮和酚類化合物含量的變化。有機(jī)肥較無機(jī)肥更有利于提高白芍中總酚類、類黃酮等的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[20]。也有研究證實(shí)，重施氮肥能夠降低薰衣草中酚類化合物的濃度[21]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于施肥對(duì)黑豆抗氧化活性影響的研究鮮有報(bào)道。本研究以未施N、P的黑豆為對(duì)照，對(duì)其他15種不同氮磷配比施肥處理的黑豆抗氧化活性進(jìn)行分析。以總黃酮、總酚、總花色苷及自由基清除作用等作為試驗(yàn)指標(biāo)，研究不同氮磷配比下小粒黑豆籽粒色差值(ΔE)、抗氧化物質(zhì)、抗氧化能力及其三者之間的關(guān)系，為小粒黑豆種質(zhì)資源的鑒選利用和優(yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以神木‘連枷條’黑豆品種為供試材料，試驗(yàn)地設(shè)在陜西省神木縣趙家溝旱作示范園內(nèi)。供試土壤0～20 cm土層pH為8.25，速效氮6.59 mg·kg-1，速效磷15.52 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)4.7 g·kg-1，前茬作物為糜子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)氮、磷2個(gè)因素(分別用尿素和磷酸鈣肥折算)，4個(gè)水平，純N分別為0、90、180、270 kg·hm-2，純P2O5分別為0、180、360、540 kg·hm-2，共16個(gè)處理，64個(gè)小區(qū)，所有小區(qū)均覆蓋地膜。小區(qū)面積30 m2(6 m×5 m),行距0.50 m，株距0.30 m，于5月上旬播種，每穴定苗1株，田間管理同大田生產(chǎn)，各處理施肥量見表1。各處理在10月中旬成熟后分區(qū)采收，籽粒脫殼后備用。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 提取液的制備 參考Prior等[22]和Korus等[23]方法制備提取液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 參考 Jia等[24]方法。用蘆丁制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以蘆丁計(jì)。

1.3.3 總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法測定。參考Xu等[25]方法。用沒食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)以沒食子酸計(jì)。

1.3.4 總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 采用pH示差法測定。參考Jeng等[26]方法。樣品中的總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì)。

1.3.5 ·OH清除作用 參考Li等[27]方法。

1.3.7 DPPH·清除作用 參考Xu等[25]方法。并將方法中的無水甲醇換為無水乙醇。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)及圖表處理，利用SPSS 19.0和SAS 8.1進(jìn)行分析。

表1 各處理施肥量設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同N、P配比對(duì)小粒黑豆抗氧化物質(zhì)的影響

2.1.1 對(duì)總黃酮和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由表2可以看出，未施N、P的小粒黑豆總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.57 mg·g-1。施肥處理后，小粒黑豆的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高。施N與施P均對(duì)小粒黑豆總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響。不同N、P配比下，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著，其中N0P2、N3P2總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為33.94和34.26 mg·g-1，較對(duì)照分別提高65.00%和66.55%。

不同N、P配比下的小粒黑豆總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯示，施肥處理后的小粒黑豆總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于未施N、P的小粒黑豆，其中N0P2、N3P2總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為26.60和25.88 mg·g-1。

由表2也可以看出，在同一施N水平下，隨著P肥的增多，小粒黑豆總黃酮與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的單峰變化趨勢(shì)。而在N3施肥水平下，則呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。在同一施P水平下，小粒黑豆黃酮與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)略有差異。隨著N肥的增多小粒黑豆總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本上呈現(xiàn)先降低后升高的單峰變化趨勢(shì)，而在P0施肥水平下分別呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)；總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本上呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，而在P0、P2施肥水平下分別呈現(xiàn)持續(xù)上升、先降低后升高的趨勢(shì)。

這可能是由于蛋白質(zhì)競爭作用[29]的結(jié)果，N、P元素均影響蛋白質(zhì)的合成，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成量不足以抑制苯丙氨酸代謝途徑，酚類物質(zhì)正常合成，呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成量多時(shí)，酚類合成受到抑制，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[30]。

2.1.2 對(duì)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由表2可以看出，不同的N、P配比中N1P2總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為1.27 mg·g-1，顯著高于未施N、P小粒黑豆總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。且除N2P0外，其他施肥處理下的小粒黑豆中總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著低于N1P2。

2.2 不同N、P配比對(duì)抗氧化能力的影響

2.2.1 對(duì)·OH清除作用的影響 不同的N、P配比處理小粒黑豆全粉提取液對(duì)·OH清除能力如圖1所示。小粒黑豆的·OH清除率均在70%以上，其中N3P0施肥處理小粒黑豆·OH清除能力最弱，為71.76%，甚至比未施N、P的小粒黑豆減少2.23%。而N3P2的·OH清除能力最強(qiáng)，達(dá)90.59%。

表2 不同N、P配比對(duì)小粒黑豆抗氧化物質(zhì)的影響

注：1.同一列中不同字母表示有顯著性差異(P≤0.05)。2.按每克干豆粉計(jì)算。3.總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)以沒食子酸計(jì)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以蘆丁計(jì)，總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì)。

Note:1.Different letters in the same column indicated significant difference(P≤0.05).2.Calculated on the dry soybean meal per gram.3.Total phenol mass fraction measured in gallic acid,total flavonoids mass fraction in rutin,the total anthocyanin mass fraction in cyanidin-3-glucoside.

2.2.3 對(duì)DPPH·清除作用的影響 不同的N、P配比處理小粒黑豆全粉提取液對(duì)DPPH·清除能力如圖3所示。未施N、P處理的DPPH·清除率最低，為84.62%，且顯著低于其他施肥處理。而N2P0和N2P3的DPPH·清除率較高，分別為95.88%和94.86%。

圖上不同字母表示有顯著性差異(P≤0.05)，下同 Different letters indicate significant difference(P≤0.05),the same below

圖2 不同N、P配比下清除能力

圖3 不同N、P配比下DPPH·清除能力

2.3 不同N、P配比種植條件下小粒黑豆籽粒色差值(ΔE)、抗氧化物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)關(guān)系

表3 不同N、P配比小粒黑豆色差值(ΔE)、抗氧化物質(zhì)、抗氧化能力相關(guān)性

注：*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著相關(guān)。

Note:* and ** mean significant correlation at the 0.05 and 0.01 levels,respectively.

3 結(jié)論與討論

不同氮磷配比對(duì)小粒黑豆抗氧化性有顯著影響。N0P2、N3P2的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別較對(duì)照提高65.00%和66.55%。N0P2、N3P2的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，較對(duì)照高出59.00%和55.00%。N1P2的總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為1.27 mg·g-1，且顯著高于對(duì)照。楊磊等[31]的研究表明，缺氮、缺磷處理能夠提高山楂根系分泌液中的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。葛芳杰等[32]的研究表明，過高、過低的N、P脅迫均會(huì)導(dǎo)致穗花狐尾藻中酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高。而Biesiada等[21]的研究表明，重氮施肥能夠降低薰衣草酚類化合物的濃度。這與本研究結(jié)果基本一致。

結(jié)合不同N、P配比施肥處理對(duì)試驗(yàn)所涉及的抗氧化物質(zhì)、抗氧化能力指標(biāo)，綜合認(rèn)定每公頃施N 270 kg，P2O5360 kg；N 0 kg，P2O5360 kg；N 90 kg，P2O5360 kg分別為小粒黑豆高總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)、高總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、高總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳施肥配比。因此，可以根據(jù)不同N、P肥料配比獲得不同種類高抗氧化性小粒黑豆。

參考文獻(xiàn)Reference：

[1] 聶 剛,劉朝霞,杜雙奎,等.陜北小粒黑豆?fàn)I養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,36(5):511-513.

NIE G,LIU ZH X,DU SH K,etal.Analysis and evaluation of nutritional components of small black soybeans(GlycinemaxL) from north Shaanxi province [J].ActaNutrimentaSinica,2014,36(5):511-513.

[2] 鄭聰聰,蘇艷芳,黃 雄,等.黑豆乙醇萃取物中抗氧化成分的分離與鑒定[J].食品科學(xué),2015,36(6):155-160.

ZHENG C C,SU Y F,HUANG X,etal.Chemical constituents of antioxidant species in black soybean [J].FoodScience,2015,36(6):155-160.

[3] 江 甜,何 毅,祝振洲,等.黑豆蛋白的分級(jí)提取及黑豆花色苷的成分鑒定[J].食品科學(xué),2017,38(4):217-222.

JIANG T,HE Y,ZHU ZH ZH,etal.Fractional extraction of protein and characterization of anthocyanins from black soybean seeds [J].FoodScience,2017,38(4):217-222.

[4] ZEVNIK N.Black bean bonanza [J].BetterNutrition,2010.

[6] CHAVEZSANTOSCOY R A,GUTIERREZURIBE J A,GRANADOS O,etal.Flavonoids and saponins extracted from black bean(PhaseolusvulgarisL.) seed coats modulate lipid metabolism and biliary cholesterol secretion in C57BL/6 mice(1045.1) [J].BritishJournalofNutrition,2014,112(6):886-899.

[7] RONDINI E A,BENNINK M R.Microarray analyses of genes differentially expressed by diet(black beans and soy flour) during azoxymethane-induced colon carcinogenesis in rats [J].JournalofNutrition&Metabolism,2012(4):351796.

[8] KWON S H,AHN I S,KIM S O,etal.Anti-obesity and hypolipidemic effects of black soybean anthocyanins [J].JournalofMedicinalFood,2007,10(3):552-556.

[9] DO M H,LEE S S,JUNG P J,etal.Intake of fruits,vegetables,and soy foods in relation to breast cancer risk in Korean women:a case-control study [J].Nutrition&Cancer,2007,57(1):20-27.

[10] SHINOMIYA K,TOKUNAGA S,SHIGEMOTO Y,etal.Effect of seed coat extract from black soybeans on radial maze performance in rats [J].Clinical&ExperimentalPharmacology&Physiology,2005,32(9):757-760.

[11] 孫建英,常汝鎮(zhèn).中國黑大豆品種資源特征特性的分析[J].中國種業(yè),1991(1):16-18.

SUN J Y,CHANG R ZH.Analysis on the characteristics of black soybean varieties in China [J].ChinaSeedIndustry,1991(1):16-18.

[12] 鄒麗秋,王彩霞,匡雪君,等.黃酮類化合物合成途徑及合成生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2016,41(22):4124-4128.

ZOU L Q,WANG C X,KUANG X J,etal.Advance in flavonoids biosynthetic pathway and synthetic biology [J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica,2016,41(22):4124-4128.

[13] 劉大會(huì),郭蘭萍,黃璐琦,等.礦質(zhì)營養(yǎng)對(duì)藥用植物黃酮類成分合成的影響[J].中國中藥雜志,2010,35(18):2367-2371.

LIU D H,GUO L P,HUANG L Q,etal.Effects of mineral nutrition on metabolism of flavonoids in medicinal plants [J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica,2010,35(18):2367-2371.

[14] 李 娟,栗娜娜,郭世榮,等.氮營養(yǎng)對(duì)青花菜花球酚類物質(zhì)及抗氧化能力的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2008,14(6):1123-1128.

LI J,LI N N,GUO SH R,etal.Effects of different nitrogen supply level on the phenolic content and antioxidant activity in broccoli head [J].PlantNutritionandFertilizerScience,2008,14(6):1123-1128.

[15] 鄭裕國,王遠(yuǎn)山,薛亞平,等.抗氧化劑的生產(chǎn)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003.

ZHENG Y G,WANG Y SH,XUE Y P,etal.Production and Application of Antioxidants [M].Beijing:Chemical Industry Press,2003.

[16] 李穎暢,孟憲軍.藍(lán)莓花色苷抗氧化活性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(9):61-64.

LI Y CH,MENG X J.Studies on the antioxidant activity of anthocyanins from blueberry [J].FoodandFermentationIndustries,2007,33(9):61-64.

[17] 徐亞民,趙曉燕,馬 越,等.黑玉米花色苷抗氧化能力的研究[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2008(4):83-85.

XU Y M,ZHAO X Y,MA Y,etal.Study on antioxidant activity of anthocyanin pigment from black corn [J].AgriculturalScience&TechnologyandEquipment,2008(4):83-85.

[18] 薛紅瑋,陳向民,牟德華.花色苷類色素抗氧化活性研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2009,30(7):190-192.

XUE H W,CHEN X M,MU D H.A survey research on antioxidant activity of anthocyanin pigment [J].FoodResearchandDevelopment,2009,30(7):190-192.

[19] 劉 偉.不同生育期氮磷鉀脅迫對(duì)菊花黃酮類化合物的代謝調(diào)控研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

LIU W.Effect of nitrogen,phosphorus and potassium deficiency in different growth stages on the second synthesis pathway of flavonoid in chrysanthemum morifolium ramat [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2010.

[20] IBRAHIM M H,JAAFAR H Z,KARIMI E,etal.Impact of organic and inorganic fertilizers application on the phytochemical and antioxidant activity of Kacip Fatimah(LabisiapumilaBenth) [J].Molecules,2013,18(9):10973-10988.

[22] PRIOR R L,HOANG H,GU L,etal.Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity(oxygen radical absorbance capacity(ORAC(FL)) of plasma and other biological and food samples [J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2003,51(11):3273-3279.

[23] KORUS J,GUMUL D,CZECHOWSKA K.Effect of extrusion on the phenolic composition and antioxidant activity of dry beans ofPhaseolusvulgarisL.[J].FoodTechnology&Biotechnology,2007,45(2):139-146.

[24] JIA Z,TANG M,WU J.The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals [J].FoodChemistry,1999,64(4):555-559.

[25] XU B J,CHANG S K C.A comparative study on phenolic profiles and antioxidant activities of legumes as affected by extraction solvents [J].JournalofFoodScience,2007,72(2):159-166.

[26] JENG T L,YI J S,WU M T,etal.Comparisons of flavonoids and anti-oxidative activities in seed coat,embryonic axis and cotyledon of black soybeans [J].FoodChemistry,2011,123(4):1112-1116.

[27] LI H,WANG Q.Evaluation of free hydroxyl radical scavenging activities of some Chinese herbs by capillary zone electrophoresis with amperometric detection [J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2004,378(7):1801-1805.

[28] BEAUCHAMP C,FRIDOVICH I.Superoxide dismutase:Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels [J].AnalyticalBiochemistry,1971,44(1):276-287.

[29] JONES C G,HARTLEY S E.A Protein competition model of phenolic allocation [J].Oikos,1999,86(1):27-44.

[30] ARTS M J,HAENEN G R,WILMS L C,etal.Interactions between flavonoids and proteins:effect on the total antioxidant capacity [J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2002,50(5):1184-1187.

[31] 楊 磊,呂德國,秦嗣軍,等.缺素處理對(duì)山楂根系黃酮代謝的影響[J].果樹學(xué)報(bào),2010(3):363-367.

YANG L,Lü D G,QIN S J,etal.Effects of nutritional elements on the metabolism of flavonoids in roots of hawthorn [J].JournalofFruitScience,2010(3):363-367.

[32] 葛芳杰,劉碧云,魯志營,等.不同氮、磷濃度對(duì)穗花狐尾藻生長及酚類物質(zhì)含量的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(2):472-479.

GE F J,LIU B Y,LU ZH Y,etal.Effects of different nitrogen and phosphorus levels on the growth and total phenolic contents ofMyriophyllumspicatum[J].ActaScientiaeCircumstantiae,2012,32(2):472-479.

[33] 劉大會(huì),劉 偉,朱端衛(wèi),等.施用磷肥對(duì)菊花活性成分及清除自由基能力的影響[J].中國中藥雜志,2010,35(17):2236-2241.

LIU D H,LIU W,ZHU D W,etal.Effects of phosphate fertilizer on active ingredients and antioxidant activities of chrysanthemum morifolium [J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica,2010,35(17):2236-2241.

[34] 朱偉峰,林咸永,金崇偉,等.氮肥對(duì)不同白菜品種抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2009,35(3):299-306.

ZHU W F,LIN X Y,JIN C W,etal.Effects of nitrogen application rates on antioxidant contents and antioxidative activities in Chinese cabbage(BrassicachinensisL.) [J].JournalofZhejiangUniversity(AgricultureandLifeSciencesEdition),2009,35(3):299-306.