李婧雅 王德全 袁秀芳 黃華榮

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310000）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子大小為14～25nm，平均直徑17nm，呈對(duì)稱的二十面體，無(wú)囊膜，是目前已知最小的動(dòng)物病毒之一。根據(jù)其致病性、抗原性或基因組差異分為無(wú)致病性的豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），前者廣泛存在于豬群當(dāng)中。PCV2是仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PostweaningMultisyst emicWastingSyndrome，PMWS），豬皮炎、豬增生性壞死性間質(zhì)性肺炎與腎病綜合征（PNDS）的主要病原，PMWS是最早被認(rèn)識(shí)和確認(rèn)的由PCV2感染所致的疾病。常見(jiàn)的PMWS主要發(fā)生在5～16周齡的豬，極少感染乳豬。一般于斷奶后2～3d開始發(fā)病。PMWS主要以漸進(jìn)性消瘦、生長(zhǎng)遲緩、厭食、精神沉郁、行動(dòng)遲緩、皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難，咳嗽為特征，急性發(fā)病豬群中，病死率可達(dá)10%，但并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染的病死率可達(dá)25%以上。血清學(xué)調(diào)查表明，PCV2在世界范圍內(nèi)流行，給生豬飼養(yǎng)業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。該病受到各國(guó)農(nóng)業(yè)部門的高度重視。近年來(lái)豬圓環(huán)病毒2型已成為國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,國(guó)內(nèi)外對(duì)此已有很多報(bào)道。例如胡曉華等通過(guò)間接ELISA方法在安徽、廣東、廣西等可疑豬群中檢測(cè)PCV2陽(yáng)性率分別為100%、48.39%、100%。本研究擬通過(guò)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)法設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行合理優(yōu)化，建立一種穩(wěn)定、靈敏的針對(duì)PMWS檢測(cè)的PCR方法。利用這一方法對(duì)來(lái)自浙江省不同地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)疑似患PMWS仔豬的病料進(jìn)行PCR檢測(cè)應(yīng)用，最終為浙江省生豬飼養(yǎng)業(yè)的PMWS流行病學(xué)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料取自浙江地區(qū)帶有典型PMWS癥狀病豬的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等臟器，-80℃保存?zhèn)溆?。確診的豬偽狂犬病病料（PRV）、豬細(xì)小病毒病病料（PPV）作為特異性檢測(cè)的對(duì)照。

TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR純合試劑盒、病毒DNA提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所需大腸桿菌DH5α、pMD18-T載體購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成

通過(guò)比對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中15種PCV2病毒株的基因共有特征及PCV2 ORF2的核苷酸序列，應(yīng)用Primer Premier軟件分別設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，該對(duì)引物能夠特異擴(kuò)增PCV2中的469bp序列,而同屬的PCV1核酸序列則不能擴(kuò)增出條帶。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物序列為P1：

5’-TCCGCGGGCTGGCTGAACT-3’

下游引物序列為P2：

5’-GGGGGAAAGGGTGACGAACTGG-3’

1.2.2 病料處理及病毒DNA提取

新鮮組織用剪刀剪去脂肪、肌腱等,按1∶5加入PBS液,無(wú)菌研磨成勻漿，-70℃凍融3次，4℃，12000rpm離心5min, 取上清。用病毒DNA提取試劑盒提取病毒DNA，最后洗脫于50μlTE緩沖液中，于-20 ℃保存。

1.2.3 ORF2基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50.0μL，其中：10×Buffer 5.0μL、2.0mM MgCl2 4.0μL、200μM dNTPs 5.0μL、0.1μM PCV2-P12.0μL、0.1μM PCV2-P22.0μL、rTaq DNA ploymerase 0.5μL、DNA 模板 2.0μL。補(bǔ)足 ddH2O 至 50μL?；靹蚝笾门cBioradT100 PCR儀，擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，36 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆?。最終PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR條件優(yōu)化

以病料提取的病毒DNA為模板,設(shè)計(jì)不同復(fù)性溫度（52℃-60℃，間隔1℃）、不同引物濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、及1.2μmol/L），分別以上述的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較最終產(chǎn)物的擴(kuò)增效率。

1.2.5 敏感性測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PCV2 DNA模板的濃度，初始病毒DNA模板濃度約為10ng/μL，用TE緩沖液將混合模板作1∶10系列稀釋（10-0～10-6），每個(gè)稀釋度取2μl作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)該P(yáng)CR方法的敏感性。

1.2.6 特異性測(cè)定

常規(guī)提取非靶DNA，包括PCV1、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）基因組DNA，設(shè)置空白對(duì)照,用PCV2特異性引物及上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，檢測(cè)該方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性檢驗(yàn)

用上述建立的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)?份不同的PCV2陽(yáng)性病料DNA分別進(jìn)行6次重復(fù)性試驗(yàn)，檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序

將病料擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物基因片段連接到pUC18載體中，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，用含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，37℃培養(yǎng)16h后挑取單個(gè)白色菌落，置于含50μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，擴(kuò)增提取出的質(zhì)粒提取送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.9 浙江地區(qū)PCV2的分子流行病學(xué)調(diào)查

應(yīng)用優(yōu)化建立好的PCR方法對(duì)來(lái)自浙江不同地區(qū)142份疑似PCV2感染病豬進(jìn)行批量檢測(cè)，確定最終的感染率。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCV2基因的PCR擴(kuò)增

以臨床病料提取DNA作為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳后，可見(jiàn)469bp的特異性條帶。結(jié)果如圖1。

圖1 PCV2的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCR條件的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)在52～60℃溫度梯度下擴(kuò)增，結(jié)果為在所有溫度條件下，均擴(kuò)增出了目的片段，但52～55℃出現(xiàn)少許非特異性帶。以57℃擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)物得率最高，故將此PCR反應(yīng)的退火穩(wěn)定設(shè)置在57℃。

在引物濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，0.6-1.0μmol/L濃度的引物均可以擴(kuò)增出469bp大小的目的片段。最終人們確定下來(lái)的最佳反應(yīng)體系為10×buffer 2μL，dNTP（各10mmol/L）0.5μL，Pl、P2 各 0.5μL，Taq DNA 聚 合 酶0.2μL，DNA 模板 2μL，無(wú)菌 ddH2O添加至20μL，采用以下反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，57℃30s，72℃1min,35次循環(huán)；最后72℃延伸5min。

圖2 PCV2敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.3 敏感性測(cè)定

病料模板DNA經(jīng)過(guò)連續(xù)6次的10倍稀釋,在上述優(yōu)化后的條件下擴(kuò)增，圖2結(jié)果顯示10-5倍稀釋后（2pgDNA模板）仍能擴(kuò)增出預(yù)期大小片段，表明其敏感度達(dá)到0.1pg/ul濃度，證明該方法具有極高的靈敏度。

2.4 特異性測(cè)定

用我們?cè)O(shè)計(jì)的PCV2特異性引物擴(kuò)增PRV、PPV和PCV1病料模板DNA，電泳后不能任何條帶，說(shuō)明該P(yáng)CR方法僅對(duì)PCV2是特異的。

圖3 PCV2特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5 重復(fù)性檢測(cè)

PCR擴(kuò)增后凝膠電泳結(jié)果表明，3個(gè)樣品6次重復(fù)均檢測(cè)出陽(yáng)性條帶,證明該方法具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析表明，擴(kuò)增得到的DNA片段與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的29種PCV2核酸片段的同源性都在96%以上。證實(shí)擴(kuò)增的條帶就是PCV2的核酸序列。

2.7 浙江地區(qū)流行情況調(diào)查

采樣的142份病料中，經(jīng)我們的PCR檢測(cè)后有80份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)56.3%。說(shuō)明PCV2病毒已經(jīng)廣泛存在于浙江省各大豬場(chǎng)，這對(duì)生豬飼養(yǎng)業(yè)的疾病防控提出了挑戰(zhàn)。

3 討論

傳統(tǒng)的PCV2檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、原位核酸雜交（ISH）和免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHC）等方法，這些方法操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、存在非特異性反應(yīng)和敏感度低等缺點(diǎn)，難以滿足生豬養(yǎng)殖業(yè)疾病防控快速響應(yīng)的需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快捷等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于快速高效地對(duì)細(xì)菌和病毒等病原體的檢測(cè)。成功的PCR反應(yīng)既要高效，又要特異，其關(guān)鍵在于引物的設(shè)計(jì)。一對(duì)好的引物設(shè)計(jì)就是在擴(kuò)增效率和特異性之間尋求平衡。本研究引物設(shè)計(jì)的依據(jù)是通過(guò)比對(duì)Genebank收錄的大量PCV2核苷酸序列，在其保守區(qū)域內(nèi)尋找引物位點(diǎn)。最終我們?cè)O(shè)計(jì)出的引物可以特異地?cái)U(kuò)增出PCV2的相應(yīng)條帶，而對(duì)PRV，PPV和PCV1等病毒基因組模板不能擴(kuò)增出條帶,說(shuō)明本方法用來(lái)作為診斷PCV2感染是有效可行的。該方法從核酸的制備到檢測(cè)出結(jié)果約需4h，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，可用于疑似PCV2感染病豬的快速診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查，為規(guī)?；i場(chǎng)有效診斷防治豬圓環(huán)病毒病提供了參考依據(jù)。