李曉華,邱龍新,林志鋒,楊小燕,3

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364012;2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 龍巖 364012;3.福建省生豬疫病防控工程研究中心,福建 龍巖 364012)

副豬嗜血桿菌(Hps)主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。剖檢具纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等病變表現(xiàn)。副豬嗜血桿菌一共有15個(gè)血清型,其中血清4型和5型是中國(guó)乃至世界各地較流行的血清型[1]。該病已成為全球養(yǎng)豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病,其危害日益嚴(yán)重。

近年來(lái),該菌對(duì)抗生素的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重,常用藥物對(duì)該病已無(wú)明顯療效,而且,隨著人們對(duì)無(wú)藥物殘留、綠色食品需求的期望越來(lái)越高,抗生素在本病預(yù)防和控制等方面的應(yīng)用受到嚴(yán)格限制和逐步禁止[2]。因此,接種疫苗已成為預(yù)防和控制該病最為有效的方法之一。在副豬嗜血桿菌滅活苗研制中,選用能顯著提高體液免疫作用的佐劑對(duì)提高疫苗的效力起著重要作用[3]。

銀杏(Ginkgo biloba)是世界上最古老的孑遺植物,銀杏葉被用作藥物已有500余年的歷史[4]。近年來(lái),銀杏葉及銀杏葉提取物(EGB)已廣泛應(yīng)用于禽、豬等生產(chǎn)試驗(yàn)研究。但在有關(guān)銀杏葉及EGB應(yīng)用于疫苗中的試驗(yàn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本試驗(yàn)通過(guò)EGB中銀杏葉黃酮苷對(duì)副豬嗜血桿滅活疫苗免疫仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+/CD8+)以及血清TFN-α含量影響情況的探討,旨在為銀杏葉黃酮苷在疫苗方面的的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株 副豬嗜血桿菌血清5型 LY02分離株2013年8月分離自龍巖市某發(fā)病豬場(chǎng),由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠;體重 25 g,購(gòu)自福建吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;15日齡仔豬,購(gòu)自閩西某規(guī)?；i場(chǎng)。豬瘟、藍(lán)耳病抗體水平均合格,偽狂犬病gE抗體檢測(cè)陰性。

1.1.3試劑 大豆-酪蛋白消化物瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、瓊脂糖,均購(gòu)自O(shè)XOID公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;小牛血清,購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司;銀杏提取物(EGB),購(gòu)自德國(guó)威瑪舒培博士藥廠(chǎng)(其中,銀杏提取物原液每毫升含銀杏黃酮苷9.6 mg,萜內(nèi)酯1.47 mg);TFN-α檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司;Hps抗體試劑盒,購(gòu)自北京飛凱生物技術(shù)有限公司。

1.2副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗制備

1.2.1副豬嗜血桿菌菌液的制備 將保存的 LY02分離株復(fù)壯后,接種于 TSB液體培養(yǎng)基,37℃180 r/min搖床培養(yǎng)12 h作為種子液,再將種子液按1%體積比接種于另外3瓶TSB培養(yǎng)基中,37℃180 r/min搖床培養(yǎng) 18 h,測(cè) OD600值,計(jì)算活菌含量。

1.2.2菌液的滅活 按菌液總體積加入0.4%甲醛,置37℃搖床中滅活,24 h后取滅活菌液于TSA培養(yǎng)基劃線(xiàn)培養(yǎng),檢驗(yàn)是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.3佐劑疫苗的制備 佐劑疫苗的水相制備:用PBS將滅活菌液充分洗滌3次后離心,用 PBS稀釋總菌含量濃度至5.0×109CFU/mL,將不同濃度銀杏葉提取物黃酮苷與菌液混合制備為佐劑疫苗水相(見(jiàn)表1)。

佐劑疫苗的油相制備:取白油94份,加入6份司本-80,充分?jǐn)嚢杈鶆?高壓滅菌121℃、20 min,冷卻到室溫備用。

佐劑疫苗的乳化:水相與油相按1∶1.5比例乳化,制作成油包水滅活苗,檢驗(yàn)物理性狀,合格于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3小鼠佐劑疫苗免疫試驗(yàn) 將50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別免疫高、中、低3個(gè)濃度銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗,同時(shí),設(shè)立不加佐劑普通多價(jià)苗和注射生理鹽水陰性對(duì)照。首免,分別通過(guò)肌肉注射含佐劑滅活菌苗0.2 mL/只,空白對(duì)照組注射同等劑量生理鹽水,2周后二免,免疫途徑和劑量同首免,二免1周后用副豬嗜血桿菌桿菌血清5型強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒,攻毒方式為腹腔注射菌液0.5 mL/頭,活菌含量為 2.0 × 109CFU,連續(xù)觀(guān)察 2周(見(jiàn)表2)。

1.4仔豬佐劑疫苗免疫試驗(yàn) 將25只15日齡仔豬隨機(jī)分為5組,每組5只,分別通過(guò)頸部肌肉注射含佐劑滅活菌苗及不含佐劑普通滅活苗各2mL/頭,陰性對(duì)照組注射生理鹽水,首免14 d后進(jìn)行二免,免疫途徑和劑量同首免,二免后14 d后,用副豬嗜血桿菌桿菌血清5型強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒,攻毒方式為腹腔注射菌液3 mL/頭,活菌含量為7.5×109CFU(見(jiàn)表3)。

表2　副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗小鼠免疫攻毒試驗(yàn)

表3　副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗仔豬免疫攻毒試驗(yàn)

1.5血樣采集 分別在28、35、42日齡時(shí)采集仔豬前腔靜脈血。4 000 r/min離心25 min分離血清,-70℃冷凍保存?zhèn)溆?28、35日齡仔豬采血另一部分用肝素鈉作抗凝劑用于T細(xì)胞亞群流式檢測(cè)。

1.6TFN-α水平檢測(cè) 參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 按張紅英等[8]方法,每管加入經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定體積的 CD3ε單克隆抗體3 μL、CD4a 2 μL、CD8a 3 μL,然后加入肝素鈉抗凝血100 μL,室溫避光作用20 min,加入溶血素0.5 mL,室溫避光作用10 min,1 500 r/min離心10 min,吸去上清,用PBS洗滌3次后,1%多聚甲醛重懸細(xì)胞,進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.8組織切片的制作與觀(guān)察 采集攻毒后感染死亡豬和免疫保護(hù)豬的肺臟、肝臟、腎臟、心臟等組織,浸泡于10%福爾馬林溶液中,按常規(guī)方法進(jìn)行脫水、包埋、切片等處理,制作石蠟組織切片,H.E.染色后顯微鏡下觀(guān)察病理變化。

1.9數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,試驗(yàn)結(jié)果以Means±SD表示,當(dāng)P＜0.05時(shí)差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒結(jié)果

2.1.1小鼠攻毒結(jié)果 小鼠攻毒后4 h小鼠開(kāi)始出現(xiàn)被毛凌亂、扎堆、顫抖、不進(jìn)食等臨床癥狀,其中非免對(duì)照組最為嚴(yán)重;攻毒后14 h左右部分小鼠開(kāi)始死亡,未死亡小鼠出現(xiàn)了眼睛發(fā)紅,有黏性的分泌物,拉稀、呼吸急促、不活動(dòng)等癥狀;攻毒后48 h,未死亡小鼠恢復(fù)正?；顒?dòng),眼睛發(fā)紅、拉稀等癥狀消失?？瞻讓?duì)照組無(wú)出現(xiàn)死亡,生理活動(dòng)正常(見(jiàn)表4)。

表4　小鼠副豬嗜血桿菌5型(Hps)攻毒結(jié)果

2.1.2仔豬攻毒結(jié)果 陰性對(duì)照組:攻毒6 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,于攻毒29 h后全部死亡;疫苗對(duì)照組:攻毒8 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,于攻毒36 h后全部死亡;高濃度組:攻毒14 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,攻毒33 h后死亡4頭仔豬;中濃度組:攻毒23 h后出現(xiàn)扎堆、靜臥、精神不振等癥狀,攻毒46 h后死亡2頭仔豬;低濃度組:攻毒15 h后出現(xiàn)靜臥,3 d后精神恢復(fù),全部存活(見(jiàn)表5)。

表5　仔豬副豬嗜血桿菌5型(Hps)攻毒結(jié)果

試驗(yàn)組仔豬臨床剖檢,感染死亡的仔豬普遍出現(xiàn)心包炎、胸腔積液、腹腔積液、關(guān)節(jié)積液、肺臟纖維素性滲出嚴(yán)重、胸腔粘連等副豬嗜血桿菌感染典型病理變化,而免疫保護(hù)組仔豬心、胸腔、腹腔、關(guān)節(jié)、肺臟均無(wú)明顯病理變化。

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)觀(guān)察結(jié)果

2.2.1感染組仔豬組織學(xué)病理變化結(jié)果 肺臟表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎變化,肺泡間質(zhì)增寬增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡內(nèi)充滿(mǎn)紅細(xì)胞,肺泡結(jié)構(gòu)縮小甚至消失(見(jiàn)中插彩版圖1A);肝細(xì)胞水泡變性、細(xì)胞核溶解,胞漿淡染,竇狀隙擴(kuò)張,內(nèi)充滿(mǎn)炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞,有漿液-纖維素性滲出物(見(jiàn)中插彩版圖1B);腎小管上皮細(xì)胞脫落管間有出血,腎小球濃縮,腎小囊上皮細(xì)胞脫落,細(xì)胞核濃縮(見(jiàn)中插彩版圖1C);心肌纖維萎縮,部分心肌纖維胞漿溶解、斷裂,心肌纖維間有少量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)中插彩版圖1D)。

2.2.2免疫保護(hù)組仔豬的病理學(xué)觀(guān)察結(jié)果 免疫保護(hù)組仔豬的病理學(xué)觀(guān)察結(jié)果,肺臟(見(jiàn)中插彩版圖2A),心臟(見(jiàn)中插彩版圖2D),肝臟(見(jiàn)中插彩版圖2C)和腎臟(見(jiàn)中插彩版圖2B)等無(wú)明顯的病理變化。

2.3副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗免疫仔豬Hps抗體水平的影響 Hps抗體檢測(cè)結(jié)果,攻毒后1周(35日齡),銀杏葉黃酮苷中濃度和低濃度組的仔豬血清Hps抗體值均顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.05),而高濃度組差異不顯著,相對(duì)于陰性對(duì)照組,添加黃酮苷佐劑中濃度Hps抗體值顯著增高(P＜0.01);低濃度組的Hps抗體值差異顯著(P＜0.05)(見(jiàn)表6)。

表6　副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗免疫仔豬Hps抗體水平

2.4銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬血清中TNF-α含量的影響 銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬血清中TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果,二免后1周(28日齡),銀杏葉黃酮苷低濃度組的TNF-α含量顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.05);攻毒后1周(35日齡),銀杏葉黃酮苷低濃度組的TNF-α含量極顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.001),高濃度和中濃度組仔豬TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);攻毒后2周(42日齡),高、中、低3個(gè)濃度的TNF-α含量均有顯著提高(P＜0.05),以低濃度組提高最顯著(P＜0.001)(見(jiàn)表7)。

表7　銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬血清中TNF-α含量的影響

2.5銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 銀杏葉黃酮苷不同濃度組 CD4+、CD8+含量檢測(cè),在二免后1周(28日齡),銀杏葉黃酮苷中濃度和低濃度組均可升高外周血中的CD4+淋巴細(xì)胞亞群的比例,其中中濃度組顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.001),低濃度組顯著高于疫苗對(duì)照組(P＜0.05);僅有銀杏葉黃酮苷高濃度組可升高外周血中的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)照疫苗組,效果極顯著(P＜0.001),銀杏葉黃酮苷佐劑對(duì)外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例也有明顯的提高作用,其中中、低濃度組效果顯著(P＜0.05)。在攻毒后1周(35日齡),銀杏葉黃酮苷3個(gè)濃度組均可升高外周血中的CD4+淋巴細(xì)胞亞群的比例,效果都極顯著高于疫苗對(duì)照組 (P＜0.001),對(duì)外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例也有明顯的提高作用,效果都極顯著高于疫苗對(duì)照組 (P＜0.001),但對(duì)于外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例,均未升高(見(jiàn)表8)。

表8　銀杏葉黃酮苷對(duì)仔豬CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量變化

3　分析與討論

3.1本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),疫苗中加入銀杏葉黃酮苷,能提高仔豬對(duì)副豬嗜血桿菌血清5型強(qiáng)毒株的攻毒保護(hù)。不同濃度保護(hù)率表現(xiàn)各有不同,高濃度組仔豬保護(hù)率為20%,中濃度組仔豬保護(hù)率為40%,低濃度組仔豬保護(hù)率為100%,說(shuō)明在副豬嗜血桿菌疫苗中添加一定濃度的銀杏葉黃酮苷可提高保護(hù)率,以低濃度(1.4 mg/mL)添加量,保護(hù)效果最好。

3.2體液免疫是B細(xì)胞介導(dǎo)的一種重要的免疫反應(yīng),血清中抗體水平為評(píng)估其免疫狀況的重要指標(biāo)之一。EGB能促進(jìn)抗體的生成,增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能[5]。黃其春、楊小燕[6]等對(duì)銀杏葉提取物調(diào)節(jié)斷奶仔豬免疫功能的研究發(fā)現(xiàn),EGB能增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能、淋巴細(xì)胞活性及腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力,能夠增強(qiáng)斷奶仔豬的體液免疫功能。對(duì)實(shí)驗(yàn)仔豬在35日齡(攻毒后1周)采血檢測(cè)血清中Hps抗體水平。結(jié)果表明,銀杏葉黃酮苷中、低濃度組的仔豬血清Hps抗體值均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而高濃度組差異不顯著,說(shuō)明中、低濃度銀杏葉黃酮苷與Hps菌株滅活苗配合使用,能顯著提高疫苗免疫效力。

3.3TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起著重要作用。王國(guó)棟[7]等發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對(duì)大鼠肝臟來(lái)源的Kc的TNF-α及其蛋白質(zhì)表達(dá)呈濃度依賴(lài)性,隨著銀杏葉提取物的濃度的增加,TNF-α mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸減少,本試驗(yàn)對(duì)銀杏葉黃酮苷不同濃度組TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果顯示,各日齡中,二免后1周(28日齡)檢測(cè)結(jié)果,以低濃度組TNF-α含量顯著高于對(duì)照組,攻毒后1周(35日齡)和攻毒后2周(42日齡)檢測(cè)結(jié)果,低濃度組TNF-α含量極顯著高于對(duì)照組,高、中濃度組顯著高于對(duì)照組。

3.4細(xì)胞免疫是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體另一種重要的免疫反應(yīng),通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物T淋巴細(xì)胞數(shù)目,可以了解動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫狀況[8]。EGB能增加T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡,對(duì)細(xì)胞免疫具有促進(jìn)作用。CD 4+亞群是輔助性T淋巴細(xì)胞(Th/Ti)的標(biāo)志。這兩類(lèi)細(xì)胞都直接參與特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),而且Th/Ti細(xì)胞對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)起激發(fā)調(diào)控作用[9]。郝璐(2016)[10]等通過(guò)銀杏葉提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖和分泌功能的影響研究發(fā)現(xiàn),EGB在一定劑量范圍內(nèi)能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,能提高脾淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的比值。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)銀杏葉黃酮苷不同濃度組CD4+、CD8+含量檢測(cè),結(jié)果表明,在二免及攻毒后1周,在副豬嗜血桿菌疫苗中添加一定濃度的銀杏葉黃酮苷,可升高外周血中的 CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例,對(duì)外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例也有明顯的提高作用,但對(duì)于外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例,均未升高。熊平源等(2012)[11]采用間接免疫熒光法測(cè)定EGB對(duì)小鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGB能降低CD4-CD8+的百分率,呈反向調(diào)節(jié)作用。在本試驗(yàn)中EGB對(duì)CD8+是否也呈現(xiàn)反向調(diào)節(jié)作用,有待進(jìn)一步開(kāi)展研究。