蘇瑋瑋,趙攀攀,丁赫楠,張秀華,么 亮,呂曉研,張樹成,武 華

[華威特(江蘇)生物制藥有限公司,江蘇 泰州 225300]

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟病毒為黃病毒科瘟病毒屬成員,病毒粒子呈球形,核衣殼為二十面體對稱,為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。急性豬瘟特征是急性敗血癥、實質器官出血、壞死和梗死;慢性豬瘟呈現(xiàn)纖維素性壞死性腸炎,后期常繼發(fā)副傷寒及巴氏桿菌病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病,我國將其列為一類動物疫病[1-2]。1833年美國俄亥俄州首次發(fā)現(xiàn)了豬瘟[3],1822年法國也有豬瘟暴發(fā)報告[4],1866年以前豬瘟在歐洲和美國廣泛流行。日本首次暴發(fā)豬瘟是在1888年,隨后是中國和印度。20世紀末豬瘟在全球許多地區(qū)仍然普遍流行,目前該病在美洲、歐洲、亞洲等國家和地區(qū)呈現(xiàn)復發(fā)趨勢,一些已宣布消滅豬瘟的國家又見豬瘟復發(fā)的報道[5]。在我國雖然采取強制免疫措施,但該病仍在全國范圍之內不間斷的流行。

為了控制該病,接種安全和高效的疫苗十分重要。目前應用最廣泛的是豬瘟弱毒活疫苗,毒株包括中國豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)、日本GPE-疫苗和法國的 Thiverval疫苗。國內動物疫苗生產企業(yè)均采用的是豬瘟兔化弱毒疫苗(C株),生產工藝上大多還是采用傳統(tǒng)轉瓶方法,其缺點是費時費力、易污染、不穩(wěn)定、抗原批間差大[6]。近年來,懸浮培養(yǎng)技術已在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗中得到大規(guī)模應用,在CSFV培養(yǎng)中應用還不多,但采用微載體懸浮培養(yǎng)技術生產CSFV疫苗可以克服上述傳統(tǒng)轉瓶方法的不足。本研究應用生物反應器微載體懸浮培養(yǎng)BT細胞生產CSFV抗原,使用FAID50(半數(shù)熒光抗體感染劑量)方法測定病毒含量,試驗結果報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞與病毒 BT細胞(F11代),由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保管和供應;毒種CSFV(F12代)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保管和供應。

1.2培養(yǎng)基及血清 MEM培養(yǎng)基,購自美國Hyclone公司;新生牛血清,購自蘭州榮曄公司。

1.3抗體 抗豬瘟單克隆抗體,由華威特(江蘇)生物制藥有限公司提供;驢抗鼠熒光抗體,購自美國NOVEX公司。

1.4微載體 Cytodex 1,購自GE Healthcare Inc.

1.5生物反應器 BioFlo 310型生物反應器,最大工作體積分別為2 L和10 L,購自美國NBS生物工程公司。

1.6微載體預處理 取微載體(Cytodex 1),每克微載體用50 mL PBS(pH值7.2)緩沖液泡脹,更換PBS 3次后浸泡過夜,次日121℃滅菌30 min,更換無菌的新鮮培養(yǎng)基浸泡,備用[8]。

1.7轉瓶細胞培養(yǎng) 將解凍的BT細胞1 000 r/min離心15 min后,除去上清加入含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸并接種至175 cm2培養(yǎng)瓶中,置37℃、含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞長成致密單層時,用0.25%胰酶/EDTA消化,傳代至15 L轉瓶中培養(yǎng)。

1.8確定BT細胞最佳接種密度 將處理好的微載體按照3 g/L比例加入到2 L含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中,而后無菌加入到2 L生物反應器中。 分別按1.0 ×105個/mg、1.5 ×105個/mg、2.0 ×105個/mg、2.5 ×105個/mg 細胞密度接種,設置生物反應器參數(shù):溫度37℃、pH值7.2、溶氧50%、轉速45 r/min。培養(yǎng)24 h后取樣,然后每12 h取樣1次,鏡下觀察細胞生長情況并計數(shù)。

1.9BT細胞的微載體懸浮培養(yǎng)放大工藝驗證采用確定的細胞培養(yǎng)工藝,用2 L反應器培養(yǎng)3批BT細胞,培養(yǎng)體積2 L,當細胞密度達到4.0×106個/mL以上時,用0.25%胰酶/EDTA 消化,按1∶5比例放大至10 L生物反應器進行培養(yǎng)。

1.10確定病毒最佳接種劑量 將處理好的微載體按照3 g/L濃度加入到2 L含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中,而后無菌加入到2 L生物反應器中,按1.5×105個/mg細胞密度接種。當細胞密度達到3.0×106個/mL時,更換含2% 新生牛血清的維持液,將 CSFV 分別按感染復數(shù)(MOI)0.2、0.5、0.8、1.2接種。接種后第5天開始收獲培養(yǎng)上清液并留樣10 mL用于測定病毒含量,以后每隔4 d收獲并換液1次,連續(xù)收獲5次。

1.11微載體懸浮培養(yǎng)工藝與轉瓶培養(yǎng)工藝比較

1.11.1微載體懸浮培養(yǎng)工藝 采用確定的細胞培養(yǎng)工藝,用2 L反應器培養(yǎng)BT細胞,培養(yǎng)體積2 L,當細胞密度達到4.0×106個/mL以上時,用0.25%胰酶/EDTA消化,按1∶5比例放大至10 L生物反應器中。當細胞密度達到3.0×106個/mL時,更換含2%新生牛血清的維持液,將CSFV按MOI為0.5接種。接種后第5天開始收獲培養(yǎng)上清液并留樣10 mL用于測定病毒含量,以后每隔4 d收獲并換液1次,連續(xù)收獲5次。

1.11.2轉瓶培養(yǎng)工藝 使用15 L轉瓶,當細胞鋪滿單層時,更換含2%新生牛血清的維持液,將CSFV按MOI為 0.5接種,每瓶加入1 000 mL維持液。接種后第5天開始收獲培養(yǎng)上清液并留樣10 mL用于病毒含量測定,以后每隔4 d收獲并換液1次,連續(xù)收獲5次。

1.12病毒含量測定 病毒含量測定前2 d在96孔細胞培養(yǎng)板中繁殖BT細胞單層,當細胞單層達到板孔面積70%～80%時,用PBS洗滌細胞單層2次,將病毒樣品10倍倍比稀釋,將每個稀釋樣品加到細胞培養(yǎng)板的6個孔中,每孔100 μL,同時設陰性對照。細胞培養(yǎng)4 d后進行熒光染色FAID50,在熒光顯微鏡下觀察細胞,有特異性熒光的孔判定為陽性,無特異性熒光的孔判定為陰性,結果用Spearman-Karber方法計算出FAID50病毒含量[8]。

2　結果

2.1BT細胞最佳接種密度 采用2 L生物反應器,分別按 1.0 × 105個/mg、1.5 × 105個/mg、2.0 ×105個/mg、2.5 ×105個/mg細胞密度接種,從圖 1 細胞生長曲線可知,由于接種量不同,細胞生長密度差異明顯。當起始接種密度為1.0×105個/mg時,細胞生長緩慢,培養(yǎng)時間長且最高細胞生長密度相對較低。當起始接種密度為2.0×105/mg和2.5×105個/mg時,細胞覆蓋微載體面積相對快,但細胞死亡率高。起始接種密度為1.5×105/mg時,細胞培養(yǎng)72 h即可覆蓋微載體面積的70% ～80%,且細胞狀態(tài)良好。所以確定BT細胞最佳接種密度為1.5 ×105個/mg。

圖1　BT細胞接種密度與生長細胞密度的關系

2.2BT細胞微載體懸浮培養(yǎng)放大工藝驗證 以2 L生物反應器為種子反應器,經過4 d培養(yǎng),BT細胞密度均可達到 4.0×106個/mL(第 1批:4.2×106個/mL、第2 批:4.1 ×106個/mL、第 3 批:4.5 ×106個/mL)。用胰酶消化法消化細胞,將消化的細胞作為種子細胞與滅菌的新鮮微載體吸附后繼續(xù)在10 L生物反應器放大培養(yǎng)。經過3次重復試驗,放大到10 L生物反應器培養(yǎng)的細胞其密度在96 h時均可達到4.0×106/mL以上(見圖2)。

圖2　3批BT細胞10 L生物反應器微載體懸浮培養(yǎng)結果

2.3確定病毒最佳接種劑量 當細胞密度達到3.0×106個/mL時,CSFV 感染復數(shù)(MOI)分別按0.2、0.5、0.8、1.2 接種。 由圖 3 可知,當按 MOI為0.2接種時,收獲的抗原病毒含量較低,說明接種的病毒量較少。 當 MOI為 0.5、0.8、1.2 時,收獲的抗原病毒含量均≥106.8FAID50/mL,但相比較MOI為0.5時,抗原病毒含量最高,且初始接種量最低,所以確定最佳接種MOI為0.5。

圖3　CSFV生物反應器懸浮培養(yǎng)方式不同接種劑量與病毒含量的對比

2.4微載體懸浮培養(yǎng)工藝與轉瓶培養(yǎng)工藝比較

轉瓶培養(yǎng)和微載體懸浮培養(yǎng)的BT細胞,均接種病毒后第5天開始第1次收毒,此后每隔4 d進行再次收獲換液,連續(xù)收獲5次。對比收獲的抗原病毒含量,結果表明,微載體懸浮培養(yǎng)的CSFV病毒含量約是轉瓶生產的15倍(見圖4),生物反應器收獲1 L病毒液的產量相當于15個轉瓶的產量。

圖4　CSFV微載體懸浮培養(yǎng)與轉瓶培養(yǎng)生產方式抗原病毒含量對比

3　討論

近年來的國內調查和監(jiān)測結果顯示,非典型豬瘟特別常見,發(fā)病率和死亡率雖然偏低,但病程延長,多存在隱性感染和持續(xù)感染,造成CSFV在豬群內水平傳播、垂直傳播,同時會繼發(fā)其他細菌類疾病[9]。接種疫苗仍然是預防豬瘟的最佳手段,所以提升豬瘟疫苗質量至關重要。中國的豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)是國際上公認的安全性和免疫原性最好的疫苗株[10],國內相對應的主要產品有豬瘟活疫苗(細胞源)、豬瘟活疫苗(傳代細胞源)、豬瘟活疫苗(脾淋源)、豬瘟活疫苗(兔源)。根據(jù)2016年國內豬瘟活疫苗批簽發(fā)數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,年累計批簽發(fā)豬瘟弱毒活疫苗約34.9億頭份,其中豬瘟活疫苗(細胞源)占48.02%;豬瘟活疫苗(傳代細胞源)占24.59%;豬瘟活疫苗(脾淋源)占 20.77%;豬瘟活疫苗(兔源)占 6.62%。其中細胞源的產品占72.61%,仍是市場主導,但其質量決定因素在于抗原的有效病毒含量及抗原與成品的效力評定方法的可靠性。

本試驗基于BT細胞懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化的基礎上開展CSFV的病毒懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化及與轉瓶培養(yǎng)工藝的對比。試驗結果顯示,在3 g/L微載體濃度下,采用1.5×105個/mg的細胞初始接種密度,細胞培養(yǎng)72 h可獲得最佳細胞密度;MOI為0.5時CSFV抗原從第1次收獲到第5次收獲病毒含量均高于106.8FAID50/mL;細胞從2 L到10 L生物反應器的5倍消化放大工藝驗證獲得比較穩(wěn)定的試驗結果;懸浮培養(yǎng)工藝增殖的CSFV病毒含量約是轉瓶培養(yǎng)工藝的15倍,且相比轉瓶培養(yǎng)工藝批間穩(wěn)定。以上結果說明,CSFV可實現(xiàn)生物反應器規(guī)?；a,且相比轉瓶培養(yǎng)工藝有明顯優(yōu)勢。試驗中的CSFV均采用FAID50(半數(shù)熒光抗體感染劑量)進行病毒含量測定。FAID50測定是指應用免疫熒光方法對病毒半數(shù)組織感染量進行測定的一種方法,中華人民共和國第2270號公告已在《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯(lián)活疫苗(TJM-F92株+C株)制造及檢驗試行規(guī)程》中確認FAID50為豬瘟疫苗效力檢驗方法之一,使本次試驗的CFSV的病毒含量數(shù)據(jù)更加精準可靠。

目前動物細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)已成為生物制藥領域最重要的關鍵技術之一,是國內外生物制品企業(yè)疫苗工藝方向的首選。本次試驗采用的是微載體懸浮培養(yǎng)工藝,相對轉瓶培養(yǎng)的優(yōu)點是表面積大、細胞產量高、質量均一、病毒效價高、污染機會少[11],并且培養(yǎng)一次的收獲體積大于多次轉瓶的生產量,其結果是提高了生產效率,確保了產品的均一性與穩(wěn)定性。但微載體懸浮培養(yǎng)與純懸浮培養(yǎng)相比,成本較高,細胞消化放大工藝難度大,目前國內還沒有CSFV純懸浮方面研究的報道。商業(yè)化豬瘟細胞苗多采用牛睪丸原代細胞、豬睪丸傳代細胞(ST)轉瓶工藝,CSFV微載體懸浮工藝的疫苗已有科研單位處于新獸藥申報階段,希望本次試驗數(shù)據(jù)能為后續(xù)的豬瘟疫苗工藝提升奠定基礎。