牛奶中β-內酰胺高靈敏度檢測試劑條研制（膠體金法）

宋文 何魯江

目前，快速檢測試劑條一般采用抗原抗體反應的原理來檢測目標檢測物。但是由于牛奶樣本中蛋白質含量較高，容易干擾檢測結果，且對于靈敏度要求高，普通的抗體無法達到現場檢測靈敏度的要求。膠體金法采用受體結合的原理來檢測目標物，由于受體結合的親和力是抗原抗體結合親和力的兩個數量級以上，因此在牛奶中使用受體結合的原理來制備β-內酰胺高靈敏度檢測試劑條成為一個有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陽性奶樣、陰性奶樣、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化學試劑（采購自Sigma）。鎳柱（GE life）、PET-30a質粒（通用生物）、β-內酰胺BSA偶聯物（購自杭州隆基生物）。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（湘儀）、搖床（湘儀）、蛋白分離柱（Bio-Rad）、分光光度計（新世紀）。

1.3 方法

1.3.1 重組β-內酰胺受體制備

1.3.1.1 單克隆陽性菌體制備

①將合成的質粒凍干粉使用100μL滅菌超純水稀釋。

②吸取稀釋后的質粒溶液10μL，加入到100μL的感受態(tài)細胞中，冰浴30min。

③完成冰浴后，42℃金屬浴熱擊90s后冰浴2min。

④將制備好的感受態(tài)細胞接種于1mL LB液體培養(yǎng)基（加入終濃度萬分之一的卡納抗生素），37℃ 、250rpm培養(yǎng)1h。

⑤培養(yǎng)后的菌體吸取200μL，涂LB固體培養(yǎng)基平板（卡納抗性），37℃烘箱靜止過夜。

⑥挑取菌落生長旺盛，邊緣清晰的單菌落，接種于1mL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 、250rpm培養(yǎng)過夜。

1.3.1.2 陽性單克隆蛋白表達鑒定

①吸取單克隆菌10μL，加入到10mL LB液體培養(yǎng)基中（2管），37℃、250rpm過夜培養(yǎng)。

②將10mL培養(yǎng)好的菌體加入到250mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃ 、250rpm），每1h測試菌體濃度，當菌體吸光度超過0.6之后，加入IPTG誘導蛋白表達（4h），其中一管為對照管不進行誘導。

③將兩瓶菌液分別離心10分鐘，轉速為8000rpm，溫度設為4℃。然后棄去上清，將沉淀使用PBS稀釋攪拌30min。將稀釋后的菌體放入到細胞粉碎儀中粉碎15min。在 12000rpm的轉速下離心30min，溫度控制為4℃，保留上清。

④離心后的沉淀物使用inding Buffer A（50mM Tris，8M Urea，0.5M NaCl，pH8.0）室溫溶解10min后，12000rpm，4℃離心30min，取上清。

⑤將收集到的兩份上清進行蛋白電泳。

經蛋白電泳鑒定，β-內酰胺受體蛋白主要為包涵體表達，上清表達量較低。

1.3.2 試紙的制作

1.3.2.1 重組β-內酰胺受體標記膠體金

①500mL超純水加熱至沸騰，加入終濃度為1.5/10000的氯金酸后再加入2.25/10000的檸檬酸三鈉。攪拌反應10min后，水浴冷卻。

②100mL制備好的膠體金溶液使用0.2M碳酸鉀溶液調節(jié)PH到9.0，加入重組的β-內酰胺受體蛋白，室溫攪拌30min。

③加入1mL 10%的BSA水溶液，封閉30min。

④以12000rpm的轉速離心30min，棄去上清，沉淀使用金標保存液稀釋（Tris：0.25%、BSA：1%）回收冷藏保存。

⑤將標記好的金標溶液，使用金標稀釋液稀釋到OD540吸光度為OD5（溶液中加入終濃度為2%的蔗糖和1%的海藻糖），每個酶標孔加入稀釋的金標溶液10μL，放置于45℃烘箱過夜干燥。

1.3.2.2 β-內酰胺BSA偶聯物包被

①將β-內酰胺BSA偶聯物使用PBS稀釋到0.2mg /mL（終濃度1%蔗糖）。

②使用劃膜儀將稀釋好的β-內酰胺BSA偶聯物包被到NC膜上，45℃烘箱過夜干燥

1.3.2.3 試紙條組裝

將包被好的底板與吸水濾紙、濾膜按照正常程序組裝黏貼。

1.3.3 試紙條檢測

將青霉素使用陰性奶樣稀釋，建立梯度濃度標準品，濃度值分別為0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。該試紙條采用免疫競爭法原理，陽性為一條線，陰性為兩條線。分別吸取不同濃度值的標準質控品各100μL，使用移液器反復抽打10次后將組裝好的試紙條插入到酶標孔中10秒鐘，5min后觀察并記錄相應結果。

2 結果與討論

檢測結果（見表1）表明，該方法建立的牛奶中β-內酰胺快速檢測試紙條的靈敏度為0.5ppb，當檢測樣本中的β-內酰胺濃度超過0.5ppb將被檢出陽性。