董世桃

【摘要】 目的：研究和分析快速冷凍方法對(duì)精液冷凍復(fù)蘇后精子活力的影響。方法：從2013年7月-2016年7月所有收集到的精液標(biāo)本中選取其中的150例精液標(biāo)本作為本次的試驗(yàn)研究對(duì)象，將這150例精液標(biāo)本按照不同的冷凍方法分為觀察組和對(duì)照組兩組，各75例，對(duì)照組采用快速冷凍法進(jìn)行精液冷凍，觀察組采用液氮緩慢冷凍法進(jìn)行冷凍，冷凍時(shí)間超過(guò)24 h，觀察和分析兩組精液標(biāo)本冷凍前后前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子數(shù)量、精子存活率、精子畸形率，對(duì)比兩組精子冷凍后復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)。結(jié)果：冷凍前，兩組精液PR精子數(shù)量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；冷凍后，快速冷凍方法的精液冷凍復(fù)蘇后PR精子數(shù)量、精子存活率、精子復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)均顯著低于液氮緩慢冷凍復(fù)蘇后PR精子數(shù)量、精子存活率、精子復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：采用液氮緩慢冷凍法進(jìn)行精液冷凍會(huì)顯著提高精液冷凍復(fù)蘇后的精子前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)量、精子存活率、精子復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)，適合在精液冷凍當(dāng)中應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 精液； 精子活力； 精子冷凍復(fù)蘇率； 液氮緩慢冷凍方法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.7.078 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2018）07-0162-03

精子凍融技術(shù)是人類精子庫(kù)和輔助生殖技術(shù)當(dāng)中的其中一項(xiàng)核心技術(shù)，隨著近幾年來(lái)精子凍融技術(shù)的不斷發(fā)展，精子冷凍的方法越來(lái)越多[1]。為了給臨床實(shí)驗(yàn)提供相關(guān)方面的研究依據(jù)，本文對(duì)液氮緩慢冷凍方法對(duì)精液冷凍復(fù)蘇后精子活力的影響進(jìn)行簡(jiǎn)要的探究和分析[2]。具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2013年7月-2016年7月所有收集到的精液標(biāo)本中選取其中的150例精液標(biāo)本作為本次的試驗(yàn)研究對(duì)象，這150例精液標(biāo)本均得到本人的知情同意，這150例捐精志愿者年齡23～36歲，平均（29.37±7.63）歲，這150例捐精者均在取精前禁欲2～7 d，精液量2～5 ml，并且在15 min內(nèi)將精液完全液化，將這150例精液標(biāo)本按照不同的冷凍方法分為觀察組和對(duì)照組兩組，各75例。所有精液標(biāo)本在冷凍前的精子數(shù)都≥15×106/ml，正常形態(tài)的精子≥4%，前項(xiàng)運(yùn)動(dòng)PR精子數(shù)≥32%。兩組精液標(biāo)本精液量、冷凍時(shí)間、冷凍前精子濃度、冷凍劑的使用、PR精子數(shù)和正常形態(tài)精子、捐精者年齡等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可對(duì)比。

1.2 冷凍試劑

本次精液冷凍所選的冷凍保護(hù)劑是GYC型冷凍保護(hù)劑，這種冷凍保護(hù)劑的成分包括5%葡萄糖溶液37.4 ml，2.9%枸櫞酸鈉溶液58.6 ml，甘油56.0 ml，蛋黃48 ml，pH值為7.2的慶大霉素0.5 ml，精液與冷凍劑的比例為3：1[3]。

1.3 方法

1.3.1 精液的冷凍方法 按照精液與冷凍劑的比例將加入同一精子冷凍培養(yǎng)基的精液裝入凍存管中，并保證培養(yǎng)基和精子細(xì)胞能夠混合并保持徹底平衡，然后將凍存管卡在金屬桿的夾子上，將凍存管分為兩組，分別根據(jù)快速冷凍法和液氮緩慢冷凍法進(jìn)行冷凍，其中快速冷凍法是將凍存管直接浸入溫度為零下195 ℃的液氮罐當(dāng)中；液氮緩慢冷凍法是先將凍存管放置到溫度為4 ℃的冰箱中，放置時(shí)間為5～10 min，將其取出后放置到液氮蒸汽當(dāng)中熏10 min，然后再?gòu)囊旱羝腥〕鰞龃婀軐⑵浣氲搅阆?96 ℃的液氮罐中[4]。兩組精液的冷凍時(shí)間要超過(guò)24 h。

1.3.2 精子的解凍方法 將凍存管從冰箱中取出，并將取出的凍存管從35 ℃的水溫中進(jìn)行水浴，直至凍存管完全溶解。把解凍后精子溶液倒入事先準(zhǔn)備好的試管當(dāng)中，然后緩慢的以一滴一滴的方式將三份精子沖洗培養(yǎng)基和精子溶液進(jìn)行徹底的混合，確保精子冷凍培養(yǎng)基能夠被完全稀釋，需要注意的是這一操作要在30 s內(nèi)完成[5]。然后取300 g精子溶液進(jìn)行持續(xù)10 min離心后，將上面的清水棄除掉后，再加入適量的精子沖洗培養(yǎng)基，直到試管內(nèi)的精子溶液大約為0.5 ml，進(jìn)行精子的重懸，然后對(duì)精液進(jìn)行分析，并檢測(cè)前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子濃度、精子復(fù)蘇率和平均精子活力[6]。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

本次對(duì)精液的分析根據(jù)《世界衛(wèi)生組織WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版中的相關(guān)規(guī)程進(jìn)行精液的常規(guī)分析和精子形態(tài)學(xué)的分析，觀察和分析的內(nèi)容包括精液量、前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子濃度、精子復(fù)蘇率和平均精子活力[7-8]。精子存活率分析方法：將20μl的精液標(biāo)本和5 g/L的伊紅Y溶液按照1：1的比例混合均勻后，覆蓋上蓋玻片，靜置30 s后采用400倍的光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，其中活精子不著色，死細(xì)胞為紅色[9]。精子冷凍復(fù)蘇率=冷凍后PR精子百分率/冷凍前PR精子百分率。平均精子活力指數(shù)=（復(fù)蘇后的精子活力數(shù)/初始精液精子活力數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文所有數(shù)據(jù)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，并采用 t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷凍前兩組精液精子活力情況比較

冷凍前，兩組精液PR精子數(shù)量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 冷凍后兩組精液精子活力情況比較

冷凍后，快速冷凍方法精液冷凍復(fù)蘇后PR精子數(shù)量、精子存活率、精子復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)均顯著低于液氮緩慢冷凍法精液精子冷凍復(fù)蘇后PR精子數(shù)量、精子存活率、精子復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

精液冷凍和輔助生殖技術(shù)是不孕不育患者的福音，截至目前，精子庫(kù)的建立和供精人工授精已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，使得精子具有長(zhǎng)期保存、可以隨時(shí)取用，同時(shí)有效保證了剩余保險(xiǎn)等[10]。

雖然近幾年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的不斷發(fā)展，精液冷凍技術(shù)得到快速的發(fā)展，已經(jīng)有越來(lái)越多不同的精液冷凍方法，但是對(duì)于冷凍前后精液精子的活動(dòng)力情況，有相關(guān)人員和專家對(duì)其進(jìn)行了多方面的實(shí)驗(yàn)研究，有大量的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和文獻(xiàn)資料表明，精液冷凍復(fù)蘇后的精子活動(dòng)力就與精液的冷凍方法有一定的關(guān)系[11]。

在精子冷凍保存的過(guò)程當(dāng)中，精子不可避免地會(huì)受到一些物理和化學(xué)效應(yīng)的影響，精子冷凍的損傷機(jī)制中，與精子冷凍時(shí)膜流動(dòng)性和完整性有關(guān)，與氧化壓力的大小有關(guān)，與降溫、復(fù)蘇過(guò)程中冰晶形成后的機(jī)械損傷有關(guān)。有關(guān)研究證實(shí)，在精子冷凍的過(guò)程當(dāng)中，快速降溫會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，而緩慢冷凍所形成的冰晶在細(xì)胞外，兩者相比，細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)精子造成的損傷明顯高出許多，從這一方面來(lái)看，液氮緩慢冷凍法對(duì)精液冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力的影響明顯會(huì)小很多。

本文對(duì)精液液氮緩慢冷凍法冷凍復(fù)蘇后精子的活動(dòng)力情況進(jìn)行了簡(jiǎn)要的分析和研究，從上述結(jié)果中可以看出，液氮緩慢冷凍法冷凍復(fù)蘇后的精子前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子數(shù)量、精子存活率、精子復(fù)蘇率和平均精子活力指數(shù)等與液氮快速冷凍相比，會(huì)顯著增強(qiáng)和提高，值得在精液冷凍當(dāng)中推廣應(yīng)用[12]。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2017-08-29）