三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因克隆及其在性腺發(fā)育過程中的表達(dá)分析*

張小輝 孟憲亮 高保全 劉 萍①王竹青 張 杰 蔡 影

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306;2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;3. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

MicroRNAs(miRNA)是一類長約18～25個核苷酸的非編碼小 RNA分子，廣泛分布于真核生物中(Guarnieri et al, 2008)，主要在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因表達(dá)的調(diào)控，在細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等一系列生理過程中發(fā)揮著重要的作用(Ott et al, 2016; Li et al,2016; Shigeyasu et al, 2017; Han et al, 2013; Yan et al,2012; Nothnick et al, 2010; Passon et al, 2012)。已有研究表明，miRNA與性腺發(fā)育密切相關(guān)(Grossman et al,2016)，其在原始生殖細(xì)胞分化(Yang et al, 2016; Wu et al, 2011; Huszar et al, 2013)、卵泡發(fā)育和精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用(Modzelewski et al,2015; Kaneda et al, 2009; Kim et al, 2013)。

miRNA的合成過程受到多個基因的共同調(diào)控，其中，Drosha和Exportin 5基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Kim et al, 2016; Kuehbacher et al, 2007)。首先，在細(xì)胞核中 miRNA基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)由RNA酶ⅢDrosha剪切成前體miRNA (pre-miRNA)(Denli et al, 2004)；隨后，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行后續(xù)處理(Romero-Cordoba et al, 2014)。已有研究報道，Drosha和Exportin 5基因能夠通過調(diào)節(jié)性腺miRNA的合成，進(jìn)而調(diào)控性腺的發(fā)育(Yang et al, 2016; Wu et al, 2012;Song et al, 2007)。Yang等(2016)發(fā)現(xiàn)，Drosha能夠調(diào)控miRNA的合成，從而影響果蠅(Drosophila)原始生殖細(xì)胞的分化和卵巢的發(fā)育；Wu等(2012)發(fā)現(xiàn)，敲除雄性小鼠(Mus musculus)Drosha基因，能夠造成生殖細(xì)胞miRNAs嚴(yán)重缺失，精子發(fā)生異常，最終導(dǎo)致雄性不育；Song等(2007)發(fā)現(xiàn)，Drosha和Exportin 5基因在海膽(Strongylocentrotus purpuratus)卵巢中均有較高表達(dá)。目前，Drosha和Exportin 5基因在性腺發(fā)育調(diào)控方面的研究主要集中在模式生物中，在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)中尚未見相關(guān)報道。

三疣梭子蟹廣泛分布于中國、日本、韓國等海域，是我國重要的捕撈對象和海水養(yǎng)殖品種(管衛(wèi)兵等,2009b)。無論對于三疣梭子蟹野生資源的合理利用，還是養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，研究其繁殖生物學(xué)都是十分必要的基礎(chǔ)性工作。但目前，有關(guān)三疣梭子蟹繁殖生物學(xué)的研究還相對匱乏。本研究利用RACE技術(shù)，首次克隆了三疣梭子蟹 miRNA合成通路重要基因Drosha和Exportin 5，通過qRT-PCR分析了其在不同組織以及性腺發(fā)育不同時期的表達(dá)水平，為進(jìn)一步探究三疣梭子蟹等甲殼類性腺發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用健康三疣梭子蟹均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的實(shí)驗(yàn)基地山東昌邑海豐水產(chǎn)有限公司，在塑料箱(560 mm×360 mm×280 mm)中暫養(yǎng)7 d，持續(xù)充氧，控制水溫為20±2℃，pH=8.2，鹽度為33，氨氮含量為0.078～0.127 mg/L，亞硝酸鹽含量為 0.074～0.132 mg/L，每天換水 1/3，并清理箱底排泄物，早晚各投喂適量蛤蜊肉。

SMART RACE cDNA Amplification Kit購于Clontech公司，Trizol Reagent購于Invitrogen公司；E.Z.N.A-Gel Extraction Kit購于Omega公司；LA Taq酶，pMD18-T載體，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PrimeScript RT Reagent Kit和 SYBR-Premix Ex Taq Ⅱ均購于TaKaRa公司；實(shí)驗(yàn)中所有引物合成和測序反應(yīng)均在青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 三疣梭子蟹性腺不同發(fā)育時期組織樣品的采集

從2015年7月～2016年3月，每月于實(shí)驗(yàn)基地連續(xù)取樣，在性腺不同發(fā)育時期，每時期各取5只。參考相關(guān)文獻(xiàn)(管衛(wèi)兵等, 2009a; 吳旭干等, 2007)，根據(jù)精巢和卵巢的外部特征進(jìn)行粗略分期，取不同個體相同部位的精巢和卵巢樣品，分別固定、切片、HE染色后，根據(jù)精巢和卵巢組織學(xué)特征，確定精巢和卵巢組織的具體分期。

1.3 總RNA提取及RACE一鏈cDNA的合成

Trizol試劑提取三疣梭子蟹各組織總RNA，通過核酸定量儀和 1.0%的瓊脂糖凝膠檢測其質(zhì)量。選取質(zhì)量好的總RNA樣品，用SMART RACE Amplification Kit合成 3?和 5? RACE 的一鏈 cDNA。

1.4 三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因全長克隆

根據(jù)三疣梭子蟹性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Drosha和Exportin 5基因的序列片段，用Primer Premier 5.0設(shè)計其 3?和 5? RACE 引物(表 1)，3?和 5?末端使用Advantage 2 PCR Kit進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)用巢氏PCR方法，第 1 輪反應(yīng)使用外側(cè)引物 DS-3?-F、DS-5?-F、E-3?-F和E-5?-F，分別與UPM配對，反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，68℃ 3 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)。第 2輪反應(yīng)以第 1輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用內(nèi)側(cè)引物DS-3?-S、DS-5?-S、E-3?-S 和 E-5?-S，分別與 NUP 配對，反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用 E.Z.N.A-Gel Extraction Kit切膠回收純化，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37℃活化45 min，涂板，過夜培養(yǎng)后，通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性單克隆，菌落PCR檢測后送公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

測序得到RACE結(jié)果序列，利用Contig Express軟件，將其與三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因EST序列拼接后，獲得2個基因的cDNA全長序列。利用 ORF Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)預(yù)測其開放閱讀框，利用 Gene Tool軟件進(jìn)行序列分析。利用EditSeq軟件進(jìn)行氨基酸序列預(yù)測，利用NCBI Blastx軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列相似性比對，利用NCBI Conserved damain軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析其蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，利用ExPASy軟件(http://web.expasy.org/ compute_pi/)預(yù)測其分子量和等電點(diǎn)，利用 SingalP 4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測基因信號肽序列，利用 SOSUI軟件(http://harrier.nagahamai-bio.ac.jp/sosui/)分析其跨膜區(qū)域。從 GenBank中下載其他物種的Drosha和Exportin 5基因序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源分析，在此基礎(chǔ)上，利用MAGE 5.0軟件構(gòu)建2個基因的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的引物Tab.1 Primers used in this study

1.6 組織表達(dá)分析

用Trizol提取三疣梭子蟹的胃、眼柄、輸精管、鰓、腸、肝胰腺、腦神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、血淋巴、肌肉、心臟以及卵巢和精巢不同時期組織的總RNA(每個組織取3個個體)。使用PrimeScript RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存。

根據(jù)已獲得的三疣梭子蟹β-actin、Drosha和Exportin 5開放閱讀框序列，設(shè)計qRT-PCR引物(表1)，分析Drosha和Exportin 5基因在三疣梭子蟹不同組織(胃、眼柄、輸精管、鰓、腸、肝胰腺、腦神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、血淋巴、肌肉、心臟)及精巢和卵巢不同時期的相對表達(dá)量(每個樣品設(shè)3個重復(fù))。反應(yīng)體系為10 μl：5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×)、0.4 μl正向引物(10 μmol/L)、0.4 μl反向引物(10 μmol/L)、0.2 μl ROX Reference Dye Ⅱ (50×)、1.0 μl cDNA、3.0 μl DEPC水。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。使用2-ΔΔCt法計算Drosha和Exportin 5基因相對表達(dá)量，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因cDNA全長的獲得和序列分析

將測序得到的3?和5? RACE序列，分別與三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因EST序列拼接后，得到其cDNA全長，GenBank登錄號分別為KY625632和KY402080。序列分析顯示，Drosha基因cDNA序列全長3443 bp，包括5?非編碼區(qū)184 bp和3?非編碼區(qū)142 bp，其中，開放閱讀框3117 bp，編碼1038個氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.22，預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為121.09 kDa；Exportin 5基因cDNA序列全長5000 bp，包括3627 bp的ORF，1204 bp的3?端UTR以及169 bp的 5?端 UTR。編碼 1208個氨基酸，預(yù)測分子量為136.15 kDa，理論等電點(diǎn)為 5.86。NCBI Conserved domain軟件分析發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹Drosha基因包含2個相鄰的RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域(RⅢDa)(456～567aa)和RⅢDb(620～749aa)和 1個雙鏈 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)(755～826aa)(圖 3)。Exportin 5 基因包含 1 個IBN-N(38-111aa)結(jié)構(gòu)域和 1個 XPO-1(112-272aa)結(jié)構(gòu)域(圖 4)。同時，在 Drosha基因 RⅢDa和 RⅢDb兩結(jié)構(gòu)域中分別發(fā)現(xiàn)了RNA酶Ⅲ家族所特有的，由9個氨基酸殘基組成的特征性標(biāo)記位點(diǎn)ERLEFLGDA和 QRLEFLGDT(圖 1、圖 2)。相關(guān)在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因的編碼蛋白均沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽序列，為水溶性蛋白。

2.2 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 NCBI blastx軟件分析得知，三疣梭子蟹Drosha與日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)該蛋白的氨基酸序列同源性最高，為94%，與白蟻(Zootermopsis nevadensis)、達(dá)氏按蚊(Anopheles darlingi)和黑森癭蚊(Mayetiola destructor)的同源性分別為 79%、75%和73%。三疣梭子蟹Exportin 5與黑蟻(Lasius niger)和藍(lán)莓蜂(Habropoda laboriosa)該蛋白氨基酸序列同源性最高，為44%。

圖1 三疣梭子蟹Drosha基因cDNA序列全長以及其編碼的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of the swimming crab Drosha gene起始密碼子ATG和終止密碼子TGA均用粗線方框標(biāo)出，RⅢDa、RⅢDb和dsRBD結(jié)構(gòu)域分別用下劃線、細(xì)線方框和陰影標(biāo)出。特征性標(biāo)記位點(diǎn)(ERLEFLGDA和QRLEFLGDT)加粗標(biāo)出Start codon (ATG) and stop codon (TGA) are marked with thick boxes, the RⅢDa, RⅢDb and dsRBD domains are marked with underline, filament box and shadow, respectively. The signature motifs (ERLEFLGDA, QRLEFLGDT) are bolded

圖4 三疣梭子蟹Exportin 5蛋白的結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.4 Domain organization of the swimming crab Exportin 5 protein

利用MEGA 5.0以鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，二者均可分為脊椎動物和節(jié)肢動物兩大簇，且三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5均在節(jié)肢動物一簇中，與魚類和哺乳類等脊椎動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中，三疣梭子蟹 Drosha與日本對蝦緊密聚為一支，親緣關(guān)系最近，其次為白蟻和木蟻(Camponotus floridanus)，而三疣梭子蟹Exportin 5與水蚤(Daphnia magna)在進(jìn)化上關(guān)系最近(圖5和圖6)。

2.3 三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因組織差異表達(dá)分析

2.3.1 三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因組織表達(dá)分布 qRT-PCR分析三疣梭子蟹 Drosha和Exportin 5基因在不同組織中的相對表達(dá)量(圖 7和圖8)，結(jié)果顯示，2個基因在各種組織中均表達(dá)，其中，Drosha基因在卵巢中表達(dá)量最高(P＜0.05)，其次依次為肝胰腺和精巢，而Exportin 5基因高表達(dá)于肝胰腺(P＜0.05)，其次依次為卵巢和精巢。

圖5 基于Drosha氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹Fig.5 NJ tree based on Drosha amino acid sequences各物種 Drosha基因 GenBank登錄號：人(NP_037367.3)、中國倉鼠(ERE81427.1)、小鼠(NP_001123621.1)、水牛(BAS30507.1)、家雞(NP_001006379.1)、麝雉(KFR12253.1)、啄木鳥(KFV67625.1)、非洲爪蟾(NP_001107152.1)、斑馬魚(NP_001103942.1)、日本對蝦(ADB65770.2)、三疣梭子蟹(KY625632)、木蟻(EFN62400.1)、白蟻(KDR08017.1)、黑森癭蚊(AFX89030.1)、達(dá)氏按蚊(ETN65888.1)、巴氏果蠅(ALC42743.1)、黑腹果蠅(NP_477436.1)The GenBank accession numbers of different species’ Drosha gene were as follows: Homo sapiens(NP_037367.3), Cricetulus griseus(ERE81427.1), Mus musculus(NP_001123621.1), Bubalus bubalis(BAS30507.1), Gallus gallus(NP_001006379.1),Opisthocomus hoazin(KFR12253.1), Picoides pubescens(KFV67625.1), Xenopus tropicalis(NP_001107152.1), Danio rerio(NP_001103942.1), Marsupenaeus japonicus(ADB65770.2), Portunus trituberculatus(KY625632), Camponotus floridanus(EFN62400.1), Zootermopsis nevadensis(KDR08017.1), Mayetiola destructor(AFX89030.1), Anopheles darlingi(ETN65888.1), Drosophila busckii(ALC42743.1), Drosophila melanogaster(NP_477436.1)

圖6 基于Exportin 5氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹Fig.6 NJ tree based on Exportin 5 amino acid sequences各物種Exportin 5基因序列GenBank登錄號：木蟻(EFN62948.1)、黑蟻(KMQ95474.1)、切葉蟻(EGI70297.1)、印度跳蟻(EFN89855.1)、藍(lán)莓蜂(KOC65194.1)、水蚤(JAN75960.1)、三疣梭子蟹(KY402080)、五線鳉(SBP29565.1)、非洲齒鯉(SBP51127.1)、熱帶爪蟾(NP_989112.2)、美洲短吻鱷(KQL87848.1)、小家鼠(AAI31662.1)、黑猩猩(JAA34037.1)、人(NP_065801.1)The GenBank accession numbers of different species’ Exportin 5 gene were as follows: Camponotus floridanus(EFN62948.1),Lasius niger(KMQ95474.1), Acromyrmex echinatior(EGI70297.1), Harpegnathos saltator(EFN89855.1), Habropoda laboriosa(KOC65194.1), Daphnia magna(JAN75960.1), Portunus trituberculatus(KY402080), Aphyosemion striatum(SBP29565.1), Nothobranchius furzeri(SBP51127.1), Xenopus tropicalis(NP_989112.2), Alligator mississippiensis(KQL87848.1), Mus musculus(AAI31662.1), Pan troglodytes(JAA34037.1), Homo sapiens(NP_065801.1)

圖7 三疣梭子蟹Drosha基因在不同組織中的表達(dá)分布狀況Fig.7 The distribution of Drosha gene in different tissues of the swimming crab不同字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，下同The different lowercase letters represented the significant difference in the different tissues of swimming crab(P＜0.05), the same as below

圖8 三疣梭子蟹Exportin 5基因在不同組織中的表達(dá)分布狀況Fig.8 The distribution of Exportin 5 gene in different tissues of the swimming crab

圖9 三疣梭子蟹Drosha基因在不同發(fā)育時期精巢組織中的表達(dá)Fig.9 The expression of Drosha gene in testis of the swimming crab at different gonadal stages

圖10 三疣梭子蟹Exportin 5基因在不同發(fā)育時期精巢組織中的表達(dá)Fig.10 The expression of Exportin 5 gene in testis of the swimming crab at different gonadal stages

2.3.2 三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因在精巢不同發(fā)育時期的差異表達(dá)分析 三疣梭子蟹 Drosha和Exportin 5基因在精巢發(fā)育不同時期表達(dá)均存在差異(圖9和圖10)，但變化趨勢一致，且其在Ⅰ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05)。此外，2個基因都在精巢發(fā)育Ⅱ期高表達(dá)，之后呈下降趨勢。

2.3.3 三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因在卵巢不同發(fā)育時期的差異表達(dá)分析 三疣梭子蟹 Drosha和Exportin 5基因在卵巢發(fā)育不同時期表達(dá)量變化趨勢大致相同，均隨著卵巢發(fā)育(Ⅱ～Ⅴ期)逐漸升高，且在卵巢發(fā)育Ⅴ期，2個基因的表達(dá)量均顯著高于其他時期(P＜0.05)(圖 11和圖 12)。其中，Drosha基因在Ⅳ期也顯著高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅵ期(P＜0.05)，而Exportin 5基因在Ⅰ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅵ期表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

圖11 三疣梭子蟹Drosha基因在不同發(fā)育時期卵巢組織中的表達(dá)Fig.11 The expression of Drosha gene in the ovary of swimming crab at different gonadal stages

圖12 三疣梭子蟹Exportin 5基因在不同發(fā)育時期卵巢組織中的表達(dá)Fig.12 The expression of Exportin 5 gene in the ovary of swimming crab at different gonadal stages

Drosha和Exportin 5基因是miRNA合成通路中的重要基因，本研究克隆獲得三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因 cDNA全長序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，Drosha包含2個相鄰的RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域(RⅢDa和RⅢDb)和1個dsRBD，屬于RNA酶Ⅲ家族(Lee et al,2006; Filippov et al, 2000; Wu et al, 2000)。RⅢDa和 RⅢDb結(jié)構(gòu)域可各結(jié)合 1個 DGCR8，發(fā)揮其雙鏈RNA剪切功能(Kwon et al, 2016; Huang et al, 2012)。Exportin 5基因包含IBN-N和XPO-1兩個功能結(jié)構(gòu)域，是核質(zhì)蛋白 β家族中的一員(Brownawell et al,2002)，XPO-1是其發(fā)揮核輸出受體功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，IBN-N具體功能暫不清楚(Sharma et al, 2017)。同源分析結(jié)果顯示，三疣梭子蟹 Drosha氨基酸序列與其他無脊椎動物的相似性為 67%～94%，序列高度保守。三疣梭子蟹Exportin 5與其他無脊椎動物的同源度較低，為 39%～46%。但有研究發(fā)現(xiàn)，從低等真菌酵母菌到高等生物人類，Exportin 5與靶RNA的結(jié)合活性位點(diǎn)高度保守(Shibata et al, 2006)。

本研究對三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因組織差異性表達(dá)分析結(jié)果顯示，其在檢測的各組織中均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)差異較大，在肝胰腺和卵巢中的表達(dá)量均顯著高于其他組織，其次為精巢。該結(jié)果暗示三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因可能在性腺發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用。性腺不同發(fā)育時期的表達(dá)分析結(jié)果顯示，在性腺發(fā)育過程中，Drosha和 Exportin 5基因表達(dá)量的變化趨勢大致相同，暗示這2個基因可能協(xié)同調(diào)控三疣梭子蟹性腺發(fā)育過程。在精巢發(fā)育過程中，Drosha和Exportin 5基因在精巢發(fā)育Ⅱ期的表達(dá)量最高，之后均呈依次下降趨勢，表明兩個基因可能在精巢發(fā)育Ⅱ期發(fā)揮重要調(diào)控作用。精巢發(fā)育Ⅱ期是精子發(fā)生的重要時期，期間初級精母細(xì)胞大量分化，并減數(shù)分裂生成次級精母細(xì)胞，細(xì)胞代謝旺盛(管衛(wèi)兵等, 2009b)。Wu等(2012)敲除小鼠Drosha基因發(fā)現(xiàn)，其精母細(xì)胞存在大量基因表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，導(dǎo)致精母細(xì)胞減數(shù)分裂中斷，精子發(fā)生困難；Iwasaki等(2013)發(fā)現(xiàn)抑制小鼠胚胎纖維細(xì)胞Exportin 5基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖缺陷，表現(xiàn)為從G1期到S期過渡延遲，同時發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞周期開始前，整體miRNA水平的提高與Exportin 5的調(diào)控密不可分。由此可見，Drosha和Exportin 5基因可能參與了精子發(fā)生過程的調(diào)控，同時也暗示miRNA可能在三疣梭子蟹精母細(xì)胞的分化和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。在卵巢不同發(fā)育時期，三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因表達(dá)量從Ⅱ期到Ⅴ期均逐漸升高，且在Ⅴ期達(dá)到峰值(P＜0.05)，期間卵母細(xì)胞大量積累其減數(shù)分裂所需營養(yǎng)物質(zhì)，并逐漸發(fā)育成熟(吳旭干等, 2007)。其中，Drosha基因在Ⅳ期也顯著高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅵ期(P＜0.05)，而Exportin 5基因在Ⅰ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅵ期表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，暗示2個基因在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中的不同功能。有研究表明，在海膽成熟卵巢中Drosha和Exportin 5基因均有較高表達(dá)(Song et al,2007)。Yang等(2016)發(fā)現(xiàn)，Drosha能夠調(diào)控果蠅原始生殖細(xì)胞的分化和卵巢的發(fā)育。因此，推測這2個基因可能通過調(diào)節(jié) miRNAs的合成在三疣梭子蟹卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究首次成功克隆三疣梭子蟹 Drosha和Exportin 5基因cDNA全長序列，分析了其在三疣梭子蟹不同組織和精卵巢不同時期的表達(dá)情況，暗示Drosha和Exportin 5基因可能在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過程中發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用，為進(jìn)一步深入研究miRNA在三疣梭子蟹性腺發(fā)育過程的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

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