李曉鳳王 昕楊 兵張華琦

(1. 銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

甲硫氨酸(Met)是人和動(dòng)物必需氨基酸之一，腺苷甲硫氨酸(SAM)是它的重要代謝產(chǎn)物之一[1]。SAM是Met通過腺苷三磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)催化產(chǎn)生的，MAT有3種主要亞型：MAT I、MAT II和MAT III[2]。SAM是基因調(diào)控至關(guān)重要的甲基供體之一[2]。DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化(包括組蛋白甲基化)，是在甲基轉(zhuǎn)移酶催化、SAM作為甲基供體條件下完成的[3]。s-腺苷高半胱氨酸(SAH)為Met另一重要代謝產(chǎn)物，是通過甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化生成的，然后由SAH水解酶(AHCY)轉(zhuǎn)化為同型半胱氨酸(Hcy)[3]。因此，Met可通過以上2種代謝過程調(diào)控生物基因的甲基化狀態(tài)，從而改變基因表達(dá)和生物性狀。最新研究表明，Met參與骨骼微結(jié)構(gòu)[4]、膠原蛋白特性[4]、胚胎干細(xì)胞維持[5]、胚胎發(fā)育[5]、葡萄糖耐受[6]和泌乳[7-8]等諸多生命過程。毛發(fā)生長(zhǎng)周期分為生長(zhǎng)期、退行期和休止期，該過程受到很多因素的影響，例如日照、遺傳和營(yíng)養(yǎng)等[9-11]。然而，迄今為止，關(guān)于Met對(duì)模型動(dòng)物(小鼠)的毛發(fā)生長(zhǎng)、臟器指數(shù)的影響尚未見報(bào)道。基于此，本研究通過測(cè)量、計(jì)算不同Met濃度下小鼠的毛發(fā)直徑、長(zhǎng)度以及部分臟器指數(shù)，為Met調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)及器官毒理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小白鼠：25日齡昆明體重18～22 g，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；

Met：純度99.99%，江蘇鹽城品王貿(mào)易有限公司；

分析天平：BSM-220.3型，上海卓精儀器設(shè)備有限公司；

數(shù)顯游標(biāo)卡尺：118型，臺(tái)州艾測(cè)五金專營(yíng)店；

顯微測(cè)微尺：0.01 mm，泰州市誠倍教學(xué)設(shè)備有限公司；

手提式中藥粉碎機(jī)：BZFS-02型，西安寶正實(shí)業(yè)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG9000型，上海高致精密儀器有限公司；

真空干燥器：VA250-1型，上海君翼儀器設(shè)備有限公司；

凱氏定氮儀：K1160型，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；

氨基酸自動(dòng)分析儀：835-50型，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

80只昆明小白鼠隨機(jī)分成4組，分別用0.12%(基礎(chǔ)日糧)，0.80%，1.60%，2.40%的Met處理，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)雌、雄鼠各2只。試驗(yàn)小鼠自由采食、飲水，籠養(yǎng)，每2 d 更換小鼠墊料。飼養(yǎng)室定時(shí)通風(fēng)、采光，溫度控制在24 ℃左右，相對(duì)濕度60%左右。每天觀察記錄小白鼠采食、飲水、生長(zhǎng)發(fā)育以及健康狀況。

1.3 基礎(chǔ)日糧原料組成及養(yǎng)分測(cè)定

(1) 基礎(chǔ)日糧水分：按GB/T 5009.3—2010執(zhí)行。

(2) 干物質(zhì)：按式(1)計(jì)算干物質(zhì)。

(1)

式中：

D——干物質(zhì)含量，%；

m1——烘干前樣品重量，g；

m2——105 ℃ 5 h烘干后樣品重量，g。

(3) 蛋白質(zhì)：按GB 5009.5—2016執(zhí)行。

(4) 脂肪：按GB/T 5009.6—2003執(zhí)行。

(5) 灰分：按GB/T 5009.4—2010高溫灰化法執(zhí)行。

(6) 能量：按GB 28050—2011和GB/Z 21922—2008執(zhí)行。

(7) 氨基酸含量：采用日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.4 毛發(fā)直徑、長(zhǎng)度的測(cè)量

在毛發(fā)退行期、休止期，每組采集10只小鼠左肩胛部毛發(fā)，分別采用顯微測(cè)微法測(cè)定毛發(fā)纖維直徑，采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定毛發(fā)自然長(zhǎng)度。每只小鼠個(gè)體分別測(cè)定、記錄30根毛發(fā)的直徑、長(zhǎng)度。

1.5 臟器指數(shù)的測(cè)定

在毛發(fā)退行期、休止期，每組斷髓處死雄鼠、雌鼠各5只，剝離心臟、脾臟、肺臟、肝臟、胸腺和腎臟等，準(zhǔn)確稱量并記錄，計(jì)算各臟器的臟器指數(shù)。臟器指數(shù)按式(2)計(jì)算:

(2)

式中：

R——臟器指數(shù)；

w1——某一臟器重量，g；

w2——?jiǎng)游锘铙w重量，g。

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)日糧組成、營(yíng)養(yǎng)水平及氨基酸含量

基礎(chǔ)日糧的原料組成、營(yíng)養(yǎng)水平以及氨基酸含量分別見表1、2、3。

2.2 日糧Met對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

毛發(fā)生長(zhǎng)周期包括生長(zhǎng)期、退行期和休止期，該過程受到諸多因素的影響，例如日照、遺傳及營(yíng)養(yǎng)等[9-11]。由圖1可知，0.80%，1.60%，2.40% 3種處理顯著降低退行期毛發(fā)直徑，顯著降低退行期、休止期毛發(fā)長(zhǎng)度(P<0.05)。退行期，0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的毛發(fā)直徑顯著低于0.12% 處理的(P<0.05)，0.80%，1.60% 2種處理的顯著低于2.40%處理的(P<0.05)，但0.80%與1.60% Met組差異不顯著(P>0.05)；休止期，各處理組毛發(fā)直徑差異不顯著(P>0.05)；退行期，0.80%，1.60% 2種處理的毛發(fā)長(zhǎng)度顯著低于0.12%和2.40%處理的(P<0.05)，但0.80%處理與1.60%處理、0.12% 處理與2.40%處理的毛發(fā)長(zhǎng)度差異不顯著(P>0.05)；休止期，0.80%，1.60% 2種處理的毛發(fā)長(zhǎng)度顯著低于0.12%和2.40%處理的(P<0.05)，且1.60%處理的顯著低于0.80%處理的(P<0.05)，但0.12%處理與2.40%處理的毛發(fā)長(zhǎng)度差異不顯著(P>0.05)。Zhang等[12]在蛋白質(zhì)含量為24%日糧中添加0.74%Met，顯著提高貂的毛發(fā)長(zhǎng)度與直徑(P<0.05)，與本研究結(jié)果恰好相反，此種現(xiàn)象差異可能是日糧中蛋白質(zhì)水平、各種氨基酸含量、平衡狀態(tài)的差異或者三者共同作用的結(jié)果。另外，高濃度日糧Met可能增加機(jī)體整體甲基化程度，從而改變毛發(fā)生長(zhǎng)密切相關(guān)的基因表達(dá)模式，最終抑制毛發(fā)生長(zhǎng)[12]。

表1 基礎(chǔ)日糧的原料組成

表2 基礎(chǔ)日糧的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(風(fēng)干物質(zhì))

表3 基礎(chǔ)日糧的氨基酸含量(風(fēng)干基礎(chǔ))

*表示組間差異顯著(P<0.05)

2.3 日糧Met濃度對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

研究表明，Met濃度對(duì)機(jī)體肝臟代謝和健康具有重要影響[13]。由圖2(a)可知，日糧Met濃度對(duì)小鼠毛發(fā)退行期心指數(shù)、肝指數(shù)和胸腺指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，但對(duì)其他臟器指數(shù)有不同程度的影響。0.12%，0.80%，2.40% 3種處理的肝指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但1.60%處理的肝指數(shù)有增加趨勢(shì)(P=0.052)；0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的脾指數(shù)顯著高于0.12%處理的(P<0.05)，但前三者差異不顯著(P>0.05)； 0.80%，1.60% 2種處理的肺指數(shù)顯著高于0.12%和2.40%處理的(P<0.05)，但0.80%處理與1.60%處理、0.12% 處理與2.40%處理的差異均不顯著(P>0.05)；0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的腎指數(shù)顯著高于0.12%處理的(P<0.05)，但前三者差異亦不顯著(P>0.05)；各處理組心指數(shù)、胸腺指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

由圖2(b)可知，日糧Met濃度對(duì)小鼠毛發(fā)休止期心指數(shù)、脾指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，但對(duì)其他臟器指數(shù)有不同程度影響。0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的肝指數(shù)顯著低于0.12%處理的(P<0.05)，但前三者之間差異不顯著(P>0.05)； Sanchez-Roman等[14]對(duì)老年大鼠進(jìn)行日糧Met限制，發(fā)現(xiàn)肝臟線粒體活性氧的產(chǎn)生減少，逆轉(zhuǎn)了機(jī)體衰老狀況。Eriksson等[15]發(fā)現(xiàn)日糧Met對(duì)維持小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)還原狀態(tài)是必須的。本研究發(fā)現(xiàn)，休止期高濃度(0.80%和1.60%)Met顯著降低肝指數(shù)，即肝臟發(fā)生萎縮現(xiàn)象，可能是高濃度Met對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，影響到肝細(xì)胞的增殖和凋亡。

由圖2(b)可知，1.60%處理的肺指數(shù)、腎指數(shù)顯著高于0.12%，0.80%，2.40% 3種處理的(P<0.05)，但后三者之間差異不顯著(P>0.05)；1.60%，2.40% 2種處理的胸腺指數(shù)顯著高于0.80%處理的，2.40%處理的胸腺指數(shù)顯著高于0.12% 處理的(P<0.05)，但0.12%處理和1.60%處理的胸腺指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；各處理組心指數(shù)、脾指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。研究[16-17]表明，過量Met顯著降低腎臟的抗氧化能力，增加腎臟活性氧(ROS)的積累。Cooke等[16]研究顯示，Met小鼠腎臟涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)的基因(Aqp2、Scnn1a、和Slc6a19等)發(fā)生上調(diào)受到限制，而這些基因參與維持滲透壓平衡，另外小鼠腎臟滲透壓的改變是腎臟發(fā)生萎縮或水腫的重要原因之一。本研究結(jié)果顯示：高濃度(0.80%和1.60%)Met顯著提高腎臟指數(shù)，即腎臟發(fā)生水腫現(xiàn)象，與Cooke等[16]研究基本相符，可能的機(jī)制是高濃度Met使維持肝臟滲透壓的基因(Aqp2、Scnn1a和Slc6a19等)表達(dá)發(fā)生變化，從而發(fā)生水腫。

*表示組間差異顯著(P<0.05)

2.4 性別對(duì)不同日糧Met濃度條件下休止期小鼠臟器指數(shù)的影響

由圖3可知，日糧Met濃度為1.60%時(shí)，雌鼠心指數(shù)顯著高于雄鼠(P<0.05)，其他Met濃度條件下差異不顯著(P>0.05)；日糧Met濃度為0.12%時(shí)，雌鼠肝指數(shù)顯著高于雄鼠(P<0.05)，其他Met濃度條件下差異不顯著(P>0.05)；日糧Met濃度為0.12%，2.40%時(shí)，雄鼠肝脾指數(shù)顯著高于雌鼠(P<0.05)，但日糧Met濃度為1.60%時(shí)，雌鼠肝脾指數(shù)顯著高于雄鼠(P<0.05)；雄鼠、雌鼠肺指數(shù)在不同硫氨酸濃度條件下無顯著差異，且肺指數(shù)具有相同的變化規(guī)律，即先升高后降低，當(dāng)Met濃度為1.60%時(shí)，達(dá)到峰值(P>0.05)；當(dāng)Met濃度為1.60%，2.40%時(shí)，雌鼠腎指數(shù)顯著高于雄鼠，其他Met濃度條件下差異不顯著(P>0.05)；在Met為0.12%，0.80%，1.60%，2.40%時(shí)，雄、雌鼠胸腺指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。陳華等[18]研究表明，性別對(duì)Wistar大鼠、SD大鼠的心指數(shù)、腎指數(shù)和肝指數(shù)均無顯著性影響，但雄鼠的肺指數(shù)顯著低于雌鼠(P<0.05)，另外SD雄鼠的脾指數(shù)顯著低于雌鼠(P<0.05)。與本研究結(jié)果不一致，由此推測(cè)，Met濃度與性別可能存在互作關(guān)系，從而改變機(jī)體臟器指數(shù)。

*表示組間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

本研究通過不同Met濃度日糧處理小鼠，發(fā)現(xiàn)0.80% 和1.60% Met均顯著降低退行期、休止期毛發(fā)直徑和長(zhǎng)度，且顯著提高退行期脾指數(shù)、肺指數(shù)和腎指數(shù)，原因可能是Met濃度改變了機(jī)體整體甲基化狀態(tài)以及臟器滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)狀態(tài)。然而，具體的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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