徐席斌，劉晨濤

(1.咸陽師范學院 體育學院,陜西 咸陽 712000;2.西北大學 體育教研部，陜西 西安 710069)

目前老齡化社會的出現(xiàn),以及生活壓力增加、生活節(jié)奏加快使衰老的問題備受關注,預防衰老和延緩衰老是近幾年生命科學的研究熱點。衰老的發(fā)生發(fā)展過程與線粒體功能異常有關[1-2]。衰老的線粒體理論認為,活性氧與細胞隨年齡的增長而惡化有密切關系,而線粒體是活性氧的主要產生場所[3]。在研究衰老的預防和延緩中,藥物干預仍是主流,但其副作用和局限性共存。運動干預抗衰老因其經濟性、安全性和對機體的積極作用,使得近年來隨著研究的不斷深入[4-6]。目前，對于運動改善心肌線粒體功能預防衰老的報道較少,本研究選擇抗阻力運動作為干預手段,觀測抗阻運動對心肌線粒體結構和功能的影響,并探討其可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

30只雄性SD大鼠,其中青年大鼠(2月齡,10只)和老年鼠(24月齡,20只),購自西安交大醫(yī)學動物中心。將老年鼠隨機分為2組: 老年對照組(elderly control group, e-Ctrl,n=10)和老年抗阻力運動組(elderly resistance training group, e-RT,n=10)。青年鼠作為青年對照組(young control group, y-Ctrl,n=10)。各組大鼠每天自由攝食飲水。

1.2 運動方案

參照Bedford等[7]的方法進行老年抗阻力負重跑臺運動。大鼠背部負重為自體重的30%,跑臺速度15m/min,無坡度。每次訓練10min,間歇2min,每天6次,每周6天,共8周。

1.3 血流動力學指標檢測

大鼠稱重麻醉后,采用RM6240多通道生理信號采集處理系統(tǒng)采集信號并記錄血流動力學各項指標變化。

1.4 取 材

測試完血流動力學后,立即處死取心臟,對心臟稱量并計算心系數(shù)。

1.5 H&E染色

將在4%(體積分數(shù))中性甲醛固定液中固定的心臟組織取出,切取需要觀察部位后,依次通過濃度梯度為 70%,80%,90%,95%,100%Ⅰ,100%Ⅱ的酒精進行脫水,脫水完成后,經氯仿透明 8h后,置于石蠟中脫氯仿,最后經石蠟包埋。石蠟經5μm切片后,用二甲苯及酒精脫蠟脫水,蘇木精染色8min,伊紅復染 5min,樹膠封片。光鏡下進行觀察,拍片。

1.6 Masson染色

石蠟切片用Masson復合染色液染色5min,經0.2%(體積分數(shù))醋酸水溶液稍洗后置于5%(體積分數(shù))磷鎢酸10min,洗滌2次,苯胺藍浸染5min,洗滌2次后脫水透明封片,光鏡下進行觀察,拍片。

1.7 超微結構觀察

在低溫下切取左心室肌組織,迅速固定。經梯度漂洗、脫水后用Epon812包埋,進行超薄50～60nm切片,醋酸鈾檸檬酸鉛雙染,日立 H-7650透射電鏡觀察,拍攝。

1.8 Western Blot

采用BCA蛋白定量試劑盒對心肌組織實施總蛋白濃度測定。將定量后的總蛋白用10%(體積分數(shù))SDS-PAGE分離,NC膜進行轉膜,3%(體積分數(shù))BSA封閉45min,孵育一抗Anti-PGC1 alpha 抗體(1∶1 000),Anti-SIRT1抗體(1∶800), Anti-AMPK alpha 1(1∶600),Anti-AMPK alpha 2(1∶1 000),24℃過夜。復溫1h后TBST洗膜3次, 3min/次。用山羊抗兔的二抗(1∶10 000)室溫搖床孵育1h,TBST洗膜3次, 3min/次,ECL發(fā)光。GAPDH(1∶5 000)作為內參。用Quantity One4.62軟件分析并計算蛋白表達量變化。

1.9 圖像處理、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準偏差(x±SD)表示用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。采用 GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結 果

2.1 抗阻力運動提高衰老的心功能

結果顯示,與e-Ctrl組相比,抗阻力運動顯著提高了老年鼠的心功能(P<0.01)。與y-Ctrl組相比,老年鼠的LVSP(P<0.01),LVEDP(P<0.01),+dp/dtmax(P<0.01),-dp/dtmax(P<0.01)等血流動力學參數(shù)都顯著增加。而與e-Ctrl組相比,抗阻力運動降低了老年鼠的LVSP(P<0.05),LVEDP(P<0.01),+dp/dtmax(P<0.05),-dp/dtmax(P<0.05)等血流動力學參數(shù),有統(tǒng)計學差異(見表1)。

表1 抗阻力運動對衰老心功能的影響Tab.1 The effect of resistance training on aged cardiac function

*P<0.05 與y-Ctrl組比較;**P<0.01 與y-Ctrl組比較;#P<0.05 與e-Ctrl組比較;##P<0.01 與e-Ctrl組比較。

2.2 抗阻力運動對衰老的心肌組織結構的影響

對心肌纖維的結構觀察發(fā)現(xiàn),y-Ctrl組大鼠心肌纖維呈整齊排列,心肌細胞結構完整且分布比較緊密(圖1a)。而e-Ctrl組大鼠的心肌細胞形態(tài)結構改變,心肌細胞斷裂,排列雜亂無章,且心肌細胞分布比較稀疏(圖1b)。老年組大鼠經抗阻力運動后,顯示心肌纖維排列較為整齊且分布較為緊密,體積也稍有增大(圖1c)。心肌組織Masson染色結果顯示,y-Ctrl組大鼠心肌組織結構完整,心肌細胞與膠原纖維交互分布(圖1d)。而e-Ctrl組大鼠心肌組織發(fā)生損傷,結構遭受破壞,大量心肌細胞壞死,增加的膠原纖維呈條索狀,分別包繞心肌束、部分膠原纖維融合呈深藍色,表明了膠原纖維過度增生(圖1e)。e-RT組大鼠心肌細胞明顯增多,膠原纖維顯著減少,表明抗阻力運動可改善衰老的心肌組織的結構(圖1f)。

a-c: H&E染色結果,蘇木素復染后細胞核呈紫色,伊紅染后細胞質為紅色。d-f: Masson染色結果,膠原纖維由苯胺藍染膠原纖維變?yōu)樗{色,麗春紅染心肌纖維為紅色。a和d表示y-Ctrl組,b和e表示e-Ctrl組,c和f表示e-RT組。×400 圖1 抗阻力運動對衰老的心肌組織結構的影響Fig.1 The effect of resistance training on aged myocardial structure

2.3 抗阻力運動重塑衰老的心肌線粒體結構

電鏡下,y-Ctrl組大鼠心肌細胞具有正常的超微結構,閏盤結構規(guī)則無擴張現(xiàn)象,肌節(jié)明暗帶清晰可見,線粒體形態(tài)呈帶狀排列,嵴清晰,細胞膜形態(tài)結構良好(圖2a)。而e-Ctrl組大鼠的心肌細胞發(fā)生嚴重損傷,閏盤呈不規(guī)則排列且有擴張現(xiàn)象,肌節(jié)不完整,Z線的排列也出現(xiàn)不規(guī)則,線粒體形態(tài)結構破壞,嵴消失,空泡樣形狀增多,細胞膜也有損傷現(xiàn)象(圖2b)。e-RT組大鼠心肌細胞形態(tài)結構屬于基本正常,肌節(jié)也整齊排列,Z線規(guī)則,閏盤基本規(guī)則無擴張,線粒體數(shù)量增多,嵴清晰可見(圖2c)。

a y-Ctrl組,b e-Ctrl組,c e-RT組?！?0000 圖2 抗阻力運動對衰老的心肌超微結構的影響Fig.2 The effect of resistance training on aged myocardial ultrastructure

2.4 抗阻力運動重塑衰老的心肌線粒體功能

與y-Ctrl組相比,e-Ctrl組PGC1α的表達顯著下降(P<0.01)?？棺枇顒涌梢悦黠@提高衰老誘導的PGC1α表達的降低(圖3a,P<0.05)。與y-Ctrl組相比,e-Ctrl組SIRT1的表達顯著下降(P<0.01)。則抗阻力活動也可明顯提高衰老誘導的SIRT1表達的降低(圖3b,P<0.01)。與y-Ctrl組相比,e-Ctrl組AMPKα1的表達顯著下降(P<0.01)。e-RT組AMPKα1的表達也顯著提高(圖3c,P<0.01)。衰老誘導AMPKα2的表達顯著降低(P<0.01),而抗阻力運動可以顯著緩解衰老誘導的AMPKα2表達的降低(圖3d,P<0.01)。

**P<0.01 與y-Ctrl組比較;#P<0.05 與e-Ctrl組比較;##P<0.01 與e-Ctrl組比較 圖3 抗阻力運動對衰老的心肌線粒體功能的影響Fig.3 The effect of resistance training on aged myocardial mitochondrial function

3 討 論

隨著年齡增長,機體機能逐漸下降,主要表現(xiàn)為進行性衰老過程,心臟結構發(fā)生異常變化,導致射血功能降低,血管也發(fā)生退行性變化[8-10]。研究表明,有氧運動可以降低老年大鼠的收縮壓,但并不能低至青年大鼠的收縮壓狀態(tài)[11]?？棺枇\動不僅可以提高老年大鼠的心系數(shù),而且降低老年大鼠的收縮壓和舒張壓。這可能與抗阻力運動降低老年大鼠心肌的膠原纖維沉積有密切的關系。膠原和淀粉樣蛋白的沉積,會導致動脈粥樣硬化樣斑塊,舒縮功能障礙,血管的順應性下降[11]。本研究的心肌細胞形態(tài)學觀察也表明,老年大鼠的心肌細胞大量壞死嚴重,分布稀疏,且被大量的膠原纖維包裹。導致心功能下降。而8周的抗阻力運動改善心肌細胞的結構,緩解其大量壞死的狀態(tài),且膠原纖維的含量也被降低。長期的抗阻力運動可以使心血管系統(tǒng)產生變化;提高心肌收縮能力,增強泵血功能。

心肌線粒體的超微結構和亞細胞定位會隨著年齡的增加發(fā)生顯著的改變。衰老的心肌線粒體出現(xiàn)形態(tài)的擴大且變圓,基質空泡化,嵴變短甚至消失,而抗阻力運動可以改善這種由于衰老引起的心肌線粒體超微結構的異常。其可能與抗阻力運動可以使心肌更快速地排出衰老誘導的有害代謝產物的累積,保護線粒體的結構和功能有關。

PGC1α是線粒體適應運動的一個重要調控蛋白,其不僅促進新線粒體的形成,還可以維持線粒體內蛋白質的穩(wěn)態(tài)[12]。對22月齡小鼠的研究發(fā)現(xiàn),PGC1α的過表達能夠減輕骨骼肌線粒體功能紊亂[13]。此外,PGC1α敲除小鼠的未折疊蛋白反應機制損害[14],表明通過PGC1α可以修復或者移除受損的的線粒體蛋白[15]。因此,PGC1α不僅可以通過促進新線粒體蛋白的合成,還可以通過維持線粒體蛋白對應激的反應來調控線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)。本研究表明,抗阻力運動可以提高老年大鼠心肌中PGC1α的表達,表示抗阻力運動可能通過PGC1α維持老年大鼠心肌線粒體蛋白的穩(wěn)態(tài)。SIRT1是Sirtuins家族成員之一,SIRT1的組蛋白去乙?；傅募せ羁梢源龠M多種基因的表達,減輕衰老誘導的代謝紊亂[16]。長時間的運動可以增加SIRT1的表達,并且消除年輕人和老年人之間SIRT1表達的差異[17]。與我們的研究一致,抗阻力運動提高老年大鼠心肌SIRT1的表達,使其與青年大鼠心肌SIRT1的表達幾乎一致。AMPK可以提高線粒體的生物合成,以此增加能量的產生,而失活的AMPK導致老年大鼠的線粒體含量降低[18]。隨著年齡的增長,AMPK對運動等刺激的反映逐漸遲鈍。有研究表明,經過5天的有氧運動,AMPK的活性在老年大鼠中依舊保持較低狀態(tài)[19]。因此,這樣遲鈍的信號在老年大鼠中可能會限制線粒體蛋白的合成,并且導致有害的線粒體蛋白的累積。而本研究中表明,抗阻力運動可提高老年大鼠心肌AMPK的表達。其原因可能是長期抗阻力運動導致線粒體產生適應性,從而導致AMPK的表達增加。研究表明,SIRT1與PGC1α共定位于線粒體[20],似乎是AMPK的下游,并且協(xié)調AMPK的活性[21]。因此,抗阻力運動可能通過AMPK/PGC1α/SIRT1信號通路改善老年大鼠的心肌線粒體功能。而進一步詳細的機制有待下一步探索。

綜上所述,長期抗阻力運動可以改善衰老的心功能,降低老年大鼠的收縮壓和舒張壓,保護心肌以及心肌線粒體結構的完整性,可能通過AMPK/PGC1α/SIRT1信號通路改善老年大鼠的心肌線粒體功能?？棺枇\動可作為老年人預防和延緩衰老的一種經濟安全的方法。

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