，， ， ，，，華春

藍(lán)舌病(Bluetongue,BT)是一種由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒((Bluetongue Virus, BTV)引起的，通過(guò)昆蟲(chóng)庫(kù)蠓(Culicoides)傳播的非接觸性反芻動(dòng)物傳染病[1-2]，動(dòng)物感染BTV的平均死亡率為30%，綿羊高達(dá)80%[3]。OIE將其列為須通報(bào)疾病，我國(guó)歸為一類(lèi)動(dòng)物疫病。BT流行廣泛，目前尚無(wú)有效的治療方法[4]，當(dāng)BTV的不同血清型毒株在同一區(qū)域同時(shí)流行時(shí)，容易發(fā)生基因重組，全球共有27種不同的BTV血清型，在中國(guó)已有BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-12、-15、-16、-21、-24等11種血清型被分離報(bào)道[5]，不同血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)給BTV的防控帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[6-7]。

云南省師宗縣地處滇中地區(qū)，有亞熱帶與溫帶共存的氣候特征，冬春季受大陸季風(fēng)的影響，晴天偏多，光照充足，氣候溫和干燥，夏秋季受海洋季風(fēng)的影響，陰雨偏多，光照差，氣候溫涼潮濕?？偟那闆r是終年溫和，雨熱同期，干濕分明，非常適宜蚊蟲(chóng)生長(zhǎng)[8-10]。云南BTV的傳播與媒介昆蟲(chóng)、地理環(huán)境、氣候變化都緊密相關(guān)[11]，1979年張念祖等在云南省師宗縣首次分離到藍(lán)舌病病毒，從而確定本病在我國(guó)的存在[12]。1995年由12頭BTV抗體陰性黃牛組成的監(jiān)控群在師宗縣建立，隨后監(jiān)控動(dòng)物轉(zhuǎn)陽(yáng)，成功分離到藍(lán)舌病病毒。2012年肖雷等[13]在師宗縣分離獲得67株藍(lán)舌病病毒，可見(jiàn)云南省師宗縣是藍(lán)舌病高發(fā)地區(qū)。為了解近年來(lái)云南師宗縣藍(lán)舌病病毒活動(dòng)情況，參照澳大利亞病毒監(jiān)測(cè)模式[14]，自2014年起，連續(xù)3年在云南省師宗縣五龍鄉(xiāng)建立監(jiān)控群，每年設(shè)立監(jiān)控動(dòng)物15只，從5-10月，每周采血一次，11月、12月，每月采血1次，每份血清樣品經(jīng)BTV C-ELISA檢測(cè)，連續(xù)的血清學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)可得出師宗縣近3年來(lái)藍(lán)舌病病毒的感染情況以及病毒活動(dòng)的時(shí)間規(guī)律，每份血液樣品盲傳分離病毒，根據(jù)3年分離獲得的藍(lán)舌病毒株數(shù)量及病毒的血清型，可推測(cè)出當(dāng)?shù)亓餍械乃{(lán)舌病主要血清型，對(duì)藍(lán)舌病的預(yù)警、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、流行病的研究起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)控群建立

1.1.1監(jiān)控動(dòng)物的選擇 因藍(lán)舌病病毒可引起綿羊發(fā)病和死亡，而牛和山羊多為隱性感染，所以2014-2016年每年4月篩選年齡小于1歲且藍(lán)舌病抗體檢測(cè)為陰性的10頭健康黃牛和5只健康山羊?yàn)楸O(jiān)控動(dòng)物設(shè)立監(jiān)控動(dòng)物群，3年累計(jì)設(shè)立監(jiān)控群3個(gè)，監(jiān)控動(dòng)物45頭。

1.1.2監(jiān)控動(dòng)物的管理 篩選出來(lái)的監(jiān)控動(dòng)物用耳標(biāo)進(jìn)行專(zhuān)門(mén)標(biāo)識(shí)，與其它牛羊混群放牧，禁止使用殺蟲(chóng)藥。

1.1.3采血 每年的5月到10月，每周采血1次，11月、12月，每月采血1次，每頭監(jiān)控動(dòng)物每次采集常規(guī)全血、肝素抗凝血各1管(10 mL)，常規(guī)全血分離獲得血清，-20 ℃保存，用于血清學(xué)檢測(cè)，肝素抗凝血，4 ℃保存，用于病毒分離。

1.2 血清學(xué)監(jiān)測(cè)

1.2.1實(shí)驗(yàn)材料 BTV C-ELISA檢測(cè)試劑盒由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，并僅限實(shí)驗(yàn)室使用[15]。

1.2.2檢測(cè)方法 按檢測(cè)樣品數(shù)量取出2 ℃～4 ℃保存的ELISA板，置室溫15 min，并編號(hào)；根據(jù)編號(hào)每孔加入50 μL 10%稀釋的待檢血清和陰性、陽(yáng)性、弱陽(yáng)性對(duì)照血清各2孔，空白對(duì)照加4空；同時(shí)按每孔50 μL加入競(jìng)爭(zhēng)抗體，此時(shí)每孔共100 μL液體，空白對(duì)照用稀釋液補(bǔ)充至100 μL，震蕩混勻后置37 ℃溫箱里溫育60 min；取出溫育好的板，用PBST洗液洗板2次，在吸水紙上輕輕拍干；每孔加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液震蕩混勻后置37 ℃溫箱里溫育30 min；用PBST洗液洗板5次，吸水紙上輕輕拍干；每孔加50 μL底物反應(yīng)液，37 ℃避光溫育10 min，每孔再加終止液50 μL終止反應(yīng)，37 ℃避光顯色15 min ，讀取OD450nm值。

1.2.3結(jié)果判定 檢測(cè)合格條件：兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔OD450≤0.2，兩孔間OD450差距小于0.05，兩個(gè)陰性對(duì)照空孔OD450≥1.0且<1.6，兩孔間OD450差距小于0.2。

按照抑制率(PI)=(陰性對(duì)照OD450平均值-樣品血清OD450)/陰性對(duì)照OD450平均值×100%，抑制率≥50%時(shí)判為抗體陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 病毒分離

1.3.1樣品準(zhǔn)備 在1.5 mL微量離心管中加入1 mL PBS、200 μL肝素抗凝血紅血球，顛倒混勻5次；1 000 r/min離心10 min，輕輕吸棄上清；加入800 μL滅菌雙蒸水，渦旋混勻，確保紅細(xì)胞充分裂解，準(zhǔn)備好的樣品作為接種液備用。

1.3.2接種細(xì)胞 將長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞瓶，根據(jù)血液樣品編號(hào)對(duì)細(xì)胞瓶進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品標(biāo)記2瓶；棄去細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液，取500 μL接種液接種到相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，每個(gè)樣品接種2瓶，置37 ℃培養(yǎng)箱感作1 h后加入10mLMEM維持液，再置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天觀察細(xì)胞病變情況，與對(duì)照細(xì)胞相比，病變程度以+、++、+++表示，有25%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)記做+，50%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)記做++，75%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)記做+++；連續(xù)在BHK-21細(xì)胞上傳3代，出現(xiàn)CPE的細(xì)胞瓶4 ℃保存，擴(kuò)大培養(yǎng)，存于-80 ℃冰箱，待鑒定；3代都無(wú)CPE的細(xì)胞瓶視為病毒分離陰性，可棄之。

1.4 陽(yáng)性分離物鑒定

1.4.1提取陽(yáng)性分離物的RNA 取接毒后CPE達(dá)到70%的單層培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，按TRizol試劑盒方法抽提總RNA。

1.4.2引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)基因庫(kù)提供的BTV各基因序列，通過(guò)分析軟件，對(duì)BTV較為保守的RNA7(VP7基因)片段設(shè)計(jì)引物[9]：

BTV-S7-A：5′-GTTACAATGCGCCCGACATC-3′

BTV-S7-B：5′-TGTAATGCGGCCTGTCCAT-3′

擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為555 bp。引物由大連天寶生物工程公司合成，用RNase-free ddH2O稀釋成20 pmol/μL備用。

1.4.3病毒雙鏈RNA變性 在PCR反應(yīng)管中加入所提取的核酸樣品10 μL，甲酰胺5 μL，95 ℃ 5 min，速取出置冰上。

1.4.4cDNA的制備 在PCR反應(yīng)管中加入變性好的模板RNA 8 μL，下游引物1 μL，dNTP Mixture 1 μL，65 ℃保溫10 min，冰浴2 min，置于冰上；加入10 μL提前配好混勻的反應(yīng)5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，PrimeScript Reverse Transcriptase(200 U/μL)1 μL，RNase free dH2O 4.5 μL，此時(shí)PCR反應(yīng)管里共有液體20 μL，混勻后，42 ℃ 60 min，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻，得到的cDNA溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5病毒的RT-PCR鑒定 以cDNA為模板，在50 μL PCR體系中完成反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃ 52 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)偱環(huán)；72 ℃ 5 min，4℃ 保持。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL與1 μL 6×DNA上樣Buffer混勻，點(diǎn)樣于12 g/L瓊脂糖凝膠上樣孔中，80 V電泳30 min，置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外光照射，觀察記錄結(jié)果。

1.4.6病毒血清型的鑒定 Karber方法計(jì)算TCID50，應(yīng)用南非參考毒株標(biāo)準(zhǔn)血清按《澳大利亞動(dòng)物疫病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行中和試驗(yàn)[16]。

2 結(jié) 果

自2014年建立監(jiān)控群以來(lái)，共計(jì)采血80次，收集監(jiān)控動(dòng)物血清1 200份，所有血清均在采血后1周之內(nèi)進(jìn)行BTV C-ELISA檢測(cè)，監(jiān)控動(dòng)物抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后，抗體陽(yáng)性持續(xù)5周以上，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)連續(xù)可靠。統(tǒng)計(jì)監(jiān)控動(dòng)物血清藍(lán)舌病抗體檢測(cè)結(jié)果，3年均有動(dòng)物感染，2014年感染率60%，2015年感染率為33.33%，2016年感染率為13.33%；黃牛感染率略高于山羊感染率(表1)。

表1 2014-2016年監(jiān)控動(dòng)物藍(lán)舌病感染情況統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Natural infection rate of bluetongue disease in sentinel animals from 2014 to 2016

時(shí)間采血次數(shù)動(dòng)物種類(lèi)動(dòng)物數(shù)量感染動(dòng)物數(shù)量感染率2014年28次黃牛10770%山羊5240%2015年25次黃牛10220%山羊5360%2016年27次黃牛10220%山羊500%

統(tǒng)計(jì)3年的監(jiān)控動(dòng)物藍(lán)舌病抗體檢測(cè)結(jié)果，監(jiān)控動(dòng)物感染BTV的時(shí)間均在6-10月之間，其中以7月和10月感染動(dòng)物最多，且7月連續(xù)3年都有動(dòng)物感染(圖1)。

圖1 2014-2016年監(jiān)控動(dòng)物感染BTV的數(shù)量和感染時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 Number of sentinel animals infected with BTV and the time of infection during 2014-2016

16個(gè)感染BTV的監(jiān)控動(dòng)物中有7個(gè)分離到病毒，共9株，BTV對(duì)BHK-21細(xì)胞上的病變產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞病變產(chǎn)生比較迅速，接種BHK-21細(xì)胞24 h就可以觀察到明顯細(xì)胞病變，48 h CPE可達(dá)到70%以上，細(xì)胞病變特點(diǎn)為變圓、腫脹、脫落(圖2)。

A:正常BHK-21細(xì)胞；B:感染BTV 48 h后的BHK-21細(xì)胞圖2 BTV對(duì)BHK-21細(xì)胞的致病變作用Fig.2 CPE of BHK-21 cells infected with BTV

2014年在3頭感染黃牛紅細(xì)胞內(nèi)分離獲得4株BTV共3個(gè)血清型，分別為BTV-2、4、12型，感染山羊紅細(xì)胞內(nèi)未能獲得分離毒株；2015年在1頭感染黃牛紅細(xì)胞內(nèi)分離獲得1株BTV，鑒定為BTV-9型，在3只感染山羊紅細(xì)胞內(nèi)分離獲得4株BTV，均為BTV-16型；2016年未能獲得分離毒株(表2)。

表2 2014年-2016年BTV分離鑒定情況統(tǒng)計(jì)

Tab.2 Isolation and identification of the BTV details during 2014-2016

時(shí)間分離毒株數(shù)量病毒編號(hào)血液樣品編號(hào)血清型鑒定動(dòng)物耳號(hào)采血時(shí)間2014年4株V07310933BTV-4黃牛5號(hào)2014.9.2V11310939BTV-2/12黃牛21號(hào)2014.9.2SZ111428BTV-4黃牛2號(hào)2014.9.232015年5株SZ214903BTV-9黃牛20號(hào)2015.6.30V15014933BTV-16山羊2號(hào)2015.7.7V14915259BTV-162015.7.21SZ316860BTV-16山羊3號(hào)2015.10.13SZ416979BTV-16山羊4號(hào)2015.10.202016年0株/////

2012年在師宗縣分離的藍(lán)舌病病毒包含7個(gè)血清型，分別為BTV-1、BTV-3、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-16、BTV-24型，2014年新增了2個(gè)血清型BTV-2、BTV-4型。(圖3)

圖3 近年來(lái)師宗縣分離藍(lán)舌病毒株的血清型統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Serotype of the BTV was isolated in Shizong County

3 討 論

2008-2009年云南省境內(nèi)地區(qū)牛、羊藍(lán)舌病的感染率為23.0%，其中師宗縣370份羊血清中，BTV抗體陽(yáng)性率為0%[17]。本次監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)由于監(jiān)控動(dòng)物是在自然界放牧飼養(yǎng)管理，干擾試驗(yàn)結(jié)果因素較多，且監(jiān)控動(dòng)物數(shù)量有限，因此在檢測(cè)結(jié)果中出現(xiàn)了2016年山羊感染率為0%的情況，但2016年的黃牛感染率為20%，證明2016年仍有藍(lán)舌病病毒活動(dòng)，且3年平均牛、羊感染率為35.56%，遠(yuǎn)高于2008-2009年的調(diào)查結(jié)果，說(shuō)明藍(lán)舌病病毒在師宗縣長(zhǎng)期存在并有活躍的趨勢(shì)。

藍(lán)舌病是由庫(kù)蠓傳播的一種蟲(chóng)媒病毒病，因此藍(lán)舌病的活動(dòng)規(guī)律主要取決于庫(kù)蠓的活動(dòng)情況，1991年李華春等在調(diào)查藍(lán)舌病傳播媒介庫(kù)蠓時(shí)，曾報(bào)道云南省師宗縣多在7-10月發(fā)生藍(lán)舌病[18]，與本次監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。庫(kù)蠓在6月上旬開(kāi)始活動(dòng)，7-9月是活動(dòng)高峰期，這樣的季節(jié)性消長(zhǎng)規(guī)律使藍(lán)舌病的流行也具有明顯的周期性和季節(jié)性，也提示了藍(lán)舌病的防控關(guān)鍵時(shí)期是每年的6-10月，且殺蟲(chóng)滅蚊尤其重要。

2014-2016年，有16個(gè)監(jiān)控動(dòng)物感染BTV，從其中7個(gè)感染動(dòng)物的紅細(xì)胞內(nèi)分離到9株BTV，包含5個(gè)血清型，病毒分離效率較高，證明本研究的病毒分離方法成熟。2014年21號(hào)黃牛紅細(xì)胞內(nèi)同時(shí)分到2株病毒，且為不同的血清型，該黃?？赡鼙煌瑫r(shí)攜帶兩個(gè)血清型的媒介昆蟲(chóng)叮咬，也可能是兩個(gè)攜帶不同血清型的媒介昆蟲(chóng)在1周之內(nèi)都叮咬了該黃牛[19]。2015年2號(hào)山羊紅細(xì)胞內(nèi)分離到BTV-16型毒株，時(shí)隔兩周又分離到同一毒株，證明BTV在動(dòng)物紅細(xì)胞中至少存活14 d。

2012年，在師宗縣分離到的BTV毒株已包含7個(gè)血清型，2014年增加至9個(gè)，其中BTV-5、-9、-24為我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)[20]，可能還有未被發(fā)現(xiàn)的血清型，說(shuō)明師宗縣存在多種血清型的BTV流行，且以BTV-3、BTV-5、BTV-16為優(yōu)勢(shì)血清型。多種血清型同時(shí)存在，型與型之間無(wú)交叉保護(hù)，這給藍(lán)舌病的防治帶來(lái)了嚴(yán)峻考驗(yàn)，不僅需要繼續(xù)對(duì)BTV感染情況及活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行研究，還急需開(kāi)展藍(lán)舌病血清型滅活疫苗、新型疫苗研究，開(kāi)發(fā)多價(jià)藍(lán)舌病通用疫苗，建立疫苗生產(chǎn)技術(shù)儲(chǔ)備[21]。

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