陳曉峰 王承國 隋好林 牟晉華

摘要：本試驗主要研究大白菜α-微管蛋白基因受霜霉病菌誘導(dǎo)的表達(dá)特點以及病原菌侵染下微管動態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，霜霉病菌誘導(dǎo)后，大白菜抗、感病品種中兩種α-微管蛋白基因均呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)特點，且抗病品種葉片細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)較為完整。說明微管骨架在植物對抗真菌病原菌侵染中具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：霜霉病菌；微管；α-微管蛋白；微管骨架

中圖分類號：S634.1+Q786文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0009-03

Abstract This paper mainly studied the expression characteristics of the α-tubulin protein gene induced by Peronospora parasitica and the dynamic structural changes of the microtubule under the infection of Peronospora parasitica. The results showed that α-tubulin protein genes expressed in all materials after Peronospora parasitica induction， and the microtubule cytoskeleton was more complete in the resistant variety. It indicated that the microtubule cytoskeleton had a certain function in plant against fungal pathogens.

Keywords Peronospora parasitica； Microtubule； α-tubulin； Microtubule cytoskeleton

微管是真核生物細(xì)胞的重要組成部分，在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、信號識別、細(xì)胞極性的建立等方面起著至關(guān)重要的作用[1，2]。在植物生長發(fā)育過程中，微管蛋白可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞以不同的形態(tài)來適應(yīng)環(huán)境和功能的需求，同時對植物纖維素和木質(zhì)素合成、構(gòu)建完整細(xì)胞骨架均具有重要作用[3]。植物微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白基因家族組成[2，4-7]。通過對α-微管蛋白基因家族研究發(fā)現(xiàn)，該基因家族具有保守性，其在結(jié)構(gòu)上非常相似，但在植物誘導(dǎo)表達(dá)和組織特異性表達(dá)上不盡相同[2，4]。

近幾年，關(guān)于微管骨架在植物抗性中的作用越來越受到重視，研究人員對其在改變植物生化特性、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，HR）等一系列抗性反應(yīng)以及微管骨架參與植物和病原菌互作中的作用進(jìn)行了研究[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，不同病原菌的侵染對微管骨架的結(jié)構(gòu)影響不完全相同，可見微管骨架在植物抗性反應(yīng)中的作用尚有需要明確的地方。而關(guān)于微管骨架在植物與病原菌互作中的動態(tài)變化，其調(diào)控因子以及在信號傳導(dǎo)中的作用等，仍然是未來研究的重點[13-16]。

本試驗對霜霉病菌誘導(dǎo)大白菜微管蛋白基因表達(dá)以及微管骨架受病原菌侵染在不同抗性材料中的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，以期了解細(xì)胞骨架在作物抗性反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

霜霉病菌、大白菜抗病品種“新煙雜3號”（XYZ-3）和感病品種“包頭蓮”（BTL）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院提供。大白菜種子消毒后，在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，待幼苗長至2～4片葉時用于試驗。

免疫熒光觀測所用果膠酶和纖維素酶、微管標(biāo)記抗體均采用Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 真菌接種液的制備和接種程序

霜霉病菌（Peronospora parasitica）接種液的制備和接種參照陳曉峰等[17]的方法，最終配成1×106個/mL孢子囊懸浮接種液。處理組每個單株葉片噴涂病原菌誘導(dǎo)液，對照組用純水代替。誘導(dǎo)處理后植株需遮光、保濕處理24 h，然后揭掉遮光物，于人工氣候箱內(nèi)20～25℃、12 h/12 h光周期、相對濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，直至采樣結(jié)束，每處理重復(fù)3次。

1.3 熒光定量PCR檢測P. parasitica誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達(dá)

1.3.1 引物設(shè)計 在GenBank大白菜數(shù)據(jù)庫中選取所需要的α-微管蛋白基因（Bra002261和Bra006517），引物設(shè)計參考文獻(xiàn)[2]，以大白菜肌動蛋白actin基因為內(nèi)標(biāo)基因，序列見表1。

1.3.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 提取處理和對照0、12、24、36、48、72、96 h大白菜葉片RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考陳曉峰等[17]的方法，每處理重復(fù)3次。

1.4 大白菜葉片細(xì)胞微管間接免疫熒光檢測

霜霉病菌誘導(dǎo)接種36 h后采集抗、感病大白菜植株葉片，參考張靜宜等[18]的方法進(jìn)行微管免疫熒光觀測。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. parasitica誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達(dá)分析

從圖1可以看出，兩個微管蛋白基因均呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)特點，在抗病品種中，兩個基因表達(dá)量均高于感病品種，經(jīng)霜霉病菌誘導(dǎo)12 h后表達(dá)量增加，誘導(dǎo)36 h均達(dá)到峰值，后逐漸下降；感病品種中，Bra006517基因表達(dá)變化趨勢與抗病品種中類似，Bra002261稍有不同，誘導(dǎo)12 h時表達(dá)量快速升高，誘導(dǎo)48 h后表達(dá)量明顯下降，72 h后恢復(fù)到起始表達(dá)量。

2.2 間接免疫熒光觀測大白菜葉片微管結(jié)構(gòu)差異

從圖2可以看出，病原菌誘導(dǎo)36 h后，抗、感病大白菜品種葉片中微管顯微結(jié)構(gòu)觀測結(jié)果不盡相同，抗病品種XYZ-3葉片細(xì)胞中圍繞細(xì)胞核周圍微管骨架結(jié)構(gòu)較為完整，感病品種BTL細(xì)胞周圍微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分散現(xiàn)象。

3 討論

目前，關(guān)于微管骨架與植物抗病性關(guān)系的研究主要集中在寄主過敏性壞死反應(yīng)（HR）和過氧化氫累積方面。通過物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)微管解聚，會降低植物過敏性壞死細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致植物對病原菌侵害抗性降低[2， 8-12，19]。通過對病原菌侵染植物組織進(jìn)行免疫熒光觀測，發(fā)現(xiàn)微管骨架聚集于侵染點或接種點周圍[13-15]，說明微管蛋白基因表達(dá)量增加直接或者間接參與了植物的抗性反應(yīng)。

微管骨架廣泛存在于植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，α-微管蛋白同分異構(gòu)體在細(xì)胞和特定組織存在空間和時間表達(dá)上的差異[2]。本研究中的兩種α-微管蛋白已被證實受紫杉醇、赤霉素（GA3）等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)[2]。本研究中我們對霜霉病菌侵染后抗、感病大白菜品種中α-微管蛋白基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)兩個α-微管蛋白基因受P. parasitica誘導(dǎo)表達(dá)，抗病品種中微管蛋白基因表達(dá)量略高于感病品種，說明微管蛋白基因可能參與植物應(yīng)對真菌病原菌侵染的抗性反應(yīng)。通過對葉片細(xì)胞中微管骨架的免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)抗病品種葉片細(xì)胞中微管骨架結(jié)構(gòu)比較完整，而感病品種細(xì)胞微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，這些都證明細(xì)胞骨架在真菌病原菌與寄主之間的抗性反應(yīng)存在一定的聯(lián)系。

下一步需要著重研究整個微管基因家族的誘導(dǎo)表達(dá)特性，以及微管蛋白表達(dá)量高底是否與植物細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)變化有一定的關(guān)聯(lián)性，同時完善病原菌誘導(dǎo)植物細(xì)胞微管骨架的動態(tài)研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Chan J， Eder M， Crowell E F， et al. Microtubules and CESA tracks at the inner epidermal wall align independently of those on the outer wall of light-grown Arabidopsis hypocotyls[J]. J. Cell Sci.， 2011， 124： 1088-1094.

[2] Zhang Y W， Jin D， Xu C， et al. Regulation of bolting and identification of the α-tubulin gene family in Brassica rapa L. ssp. pekinensis[J]. Genetics and Molecular Research， 2016，15（1）： 15017507.

[3] 饒國棟， 張建國. 植物微管蛋白基因研究進(jìn)展[J]. 世界林業(yè)研究， 2013， 26（3）： 17-20.

[4] Snustad D P， Haas N A， Kopczak S D， et al. The small genome of Arabidopsis contains at least six expressed α-tubulin genes[J]. Plant Cell， 1992， 4：539-547.

[5] Parrotta L， Cai G， Cresti M. Changes in the accumulation of α- and β-tubulin during bud development in Vitis vinifera L.[J]. Planta， 2010， 231： 277-291.

[6] Oakley R V， Wang Y S， Ramakrishna W， et al. Differential expansion and expression of α- and β-tubulin gene families in Populus[J]. Plant Physiol.， 2007， 145： 961-973.

[7] Dixon D C， Seagull R W， Triplett B A. Changes in the accumulation of α- and β-tubulin isotypes during cotton fiber development[J]. Plant Physiol.， 1994， 105： 1347-1353.

[8] 姚晶， 禹坷， 陳艷利， 等. 微管骨架在辣椒-黃瓜炭疽病菌非寄主互作中的作用[J]. 植物病理學(xué)報， 2013， 43（2）： 136-142.

[9] Skalamera D， Heath M C. Changes in the cytoskeleton accompanying infection-induced nuclear movements and the hypersensitive response in plant cells invaded by rust fungi[J]. The Plant Journal， 1998， 16（2）：191-200.

[10]Schmelzer E. Cell polarization a crucial process in fungal defense[J]. Trends in Plant Science， 2002， 7（9）：411-415.

[11]Christopher-Kozjan R， Heath M C. Cytological and pharmacological evidence that biotrophic fungi trigger different cell death execution processes in host and non-host cells during the hypersensitive response[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2003， 62（5）：265-275.

[12]Hardham A R， Jones D A， Takemoto D. Cytoskeleton and cell wall function in penetration resistance[J]. Current Opinion Plant Biology， 2007， 10（4）：342-348.

[13]Kohayashi I， Kohayashi Y， Yamaoka N， et al. Recognition of a pathogen and a nonpathogen by barley coleoptile cells. Ⅲ. Responses of microtubules and actin filaments in barley coleoptile cells to penetration attempts[J]. Canadian Journal of Botany， 1992， 70（9）： 1815-1823.

[14]Takemoto D， Hardham A R. The cytoskeleton as a regulator and target of biotic interactions in plants[J]. Plant Physiology， 2004， 136（4）： 3864-3876.

[15]Takemoto D， Jones D A， Hardham A R. GFP-tagging of cell components reveals the dynamics of subcellular reorganization in response to infection of Arabidopsis by oomycete pathogens[J]. The Plant Journal， 2003， 33（4）： 775-792.

[16]Munch S， Lingner U， Floss D S， et al. The hemi-biotrophic lifestyle of Colletotrichum species[J]. Journal of Plant Physiology， 2008， 165 （1）： 41-51.

[17]陳曉峰， 隋好林， 馬清華， 等. 霜霉病菌誘導(dǎo)大白菜幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因的表達(dá)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 47（2）： 96-99.

[18]張靜宜， 侯喜林， 史公軍， 等. 白菜組織細(xì)胞微管間接免疫熒光檢測體系的優(yōu)化[J]. 園藝學(xué)報， 2007，34（6）：1551-1554.

[19]左海， 王海燕， 馬青. 微管骨架在小麥抗條銹菌侵染中作用的研究[C]//中國植物病理學(xué)會2012年學(xué)術(shù)年會論文集. 2012.