郭春燕 王旭正 劉少杰 于金鳳

摘要：采用平板對(duì)峙法與灰色關(guān)聯(lián)度分析法從小麥和蘋果根際土壤中篩選出對(duì)小麥紋枯?。≧hizoctonia cerealis）和小麥根腐?。˙ipolaris sorokiniana）具有良好拮抗作用的放線菌，并依據(jù)菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株FX-H-51抑菌效果顯著，對(duì)不利生長(zhǎng)環(huán)境有良好的耐受性。形態(tài)學(xué)與分子鑒定結(jié)果表明，菌株FX-H-51為海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis）。

關(guān)鍵詞：放線菌；灰色關(guān)聯(lián)度分析；拮抗活性；海棠鏈霉菌

中圖分類號(hào)：S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）04-0043-05

Abstract Actinomycetes with strong antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana were screened out from wheat and apple rhizosphere soil by plate confrontation method and grey correlation degree analysis. They were identified according to the colony morphology and culture characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. The results showed that the FX-H-51 strain had significant antibacterial effect and better tolerance to the unfavorable growth environment. The morphological and molecular identification results indicated that the FX-H-51 strain was to Streptomyces spectabilis.

Keywords Actinomyces； Grey relational degree analysis； Antagonistic activity； Streptomyces spectabilis

放線菌是陸生性較強(qiáng)的原核生物，同時(shí)也是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生物研究?jī)r(jià)值的微生物資源，其中鏈霉菌屬（Steptomyces）的放線菌在植物病害生物防治中已有較多的研究報(bào)道。Coombs等[1]篩選出對(duì)小麥全蝕病有顯著防治效果的鏈霉菌菌株；陳杰等[2]從26株供試拮抗放線菌中篩選出對(duì)馬鈴薯土傳病原真菌有較強(qiáng)拮抗效果的鏈霉菌菌株。鏈霉菌在自然環(huán)境中多見(jiàn)于土壤和海洋水體，其種類豐富多樣，產(chǎn)生的抗生素及其它次生代謝物質(zhì)在植物病害生物防治方面具有重要作用[3，4]。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素中，近60%是由放線菌產(chǎn)生，其中鏈霉菌屬占90%左右[5]。

近年來(lái)，小麥土傳病害如紋枯病、根腐病[6，7]等在黃淮海麥區(qū)的發(fā)生逐年加重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失，目前生產(chǎn)上還沒(méi)有非常有效的防治方法。利用拮抗微生物防治該類土傳病害具有良好的應(yīng)用前景。

本研究在前期從土壤中分離得到大量放線菌的基礎(chǔ)上，從中篩選獲得一株對(duì)小麥紋枯病菌、根腐病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制活性的菌株FX-H-51，并對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，以期為小麥根莖部病害的綠色防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：實(shí)驗(yàn)室保存的放線菌菌株116株，分離自陜西、山西、甘肅等地的蘋果園果樹(shù)根際重茬土以及山東各地小麥田根際土。用于進(jìn)行拮抗篩選的病菌：禾谷絲核菌（WK207，Rhizoctonia cerealis）、平臍蠕孢菌（WB112，Bipolaris sorokiniana）、黃色鐮孢菌（WF25，F(xiàn)usarium culmorum），所用供試病原真菌均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌與真菌資源利用實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：菌株篩選、培養(yǎng)用高氏1號(hào)培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)及抗菌作用分析用PDA培養(yǎng)基；麥芽糖發(fā)酵培養(yǎng)基 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗放線菌菌株的初篩 采用平板對(duì)峙法[8]測(cè)定放線菌菌株對(duì)3種病原真菌的拮抗作用。25℃培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。觀察各菌株對(duì)靶標(biāo)菌的抑制效果，選取有明顯抑制圈的菌株作為復(fù)篩菌株。

1.2.2 拮抗放線菌菌株的抑菌防治效果試驗(yàn) 將初篩得到的菌株各自及組合的發(fā)酵液進(jìn)行溫室盆栽試驗(yàn)。取3種病原真菌分別接種在麥粒培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d，進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，作為接種體。小麥種子均勻播于盆中，每盆10粒，每粒附近接入1粒接種體，然后用土壤覆蓋。取5 mL發(fā)酵液分別均勻加入盆中，以不加發(fā)酵液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

1.2.3 拮抗放線菌菌株的復(fù)篩 利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)初篩得到的菌株的生防效果及耐性進(jìn)行綜合評(píng)判[9-11]。生防效果以初篩時(shí)平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果作為判定依據(jù)。耐性評(píng)價(jià)主要是菌株對(duì)溫度、酸堿性、抗生素的耐受能力，各性狀的評(píng)價(jià)指標(biāo)為：耐低溫性是10℃條件下培養(yǎng)6 d后的菌落直徑，耐高溫性是40℃條件下培養(yǎng)6 d后的菌落直徑；耐酸性是pH=3、25℃條件下培養(yǎng)6 d后的菌落直徑；耐堿性是pH=11、25℃條件下培養(yǎng)6 d后的菌落直徑；對(duì)鏈霉素的耐性是菌株在含1 mg/L鏈霉素的高氏1號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后的菌落直徑。

根據(jù)灰色系統(tǒng)理論，將所有供試菌株視為一個(gè)灰色系統(tǒng)，每一菌株都是系統(tǒng)中的單一灰因素，選取供試菌株各項(xiàng)性狀最優(yōu)值作為“參考菌株”各項(xiàng)性狀指標(biāo)，構(gòu)成的數(shù)列即參考數(shù)列X0。而比較數(shù)列Xi（i=1，2，3，4）是供試菌株各項(xiàng)性狀指標(biāo)構(gòu)成的數(shù)列，將X0與Xi進(jìn)行數(shù)據(jù)量化處理，求出各供試菌株與參考菌株的關(guān)聯(lián)度，并按關(guān)聯(lián)度大小排出關(guān)聯(lián)序。

1.2.4 菌株鑒定 形態(tài)特征觀察及生理生化特征測(cè)定參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[12]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[13]的相關(guān)內(nèi)容；分子生物學(xué)鑒定參照徐平等（2003）[14]和姜淑梅等（2007）[15]的相關(guān)內(nèi)容。以27F和ITS4為引物對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目的基因進(jìn)行克隆測(cè)序，得到菌株的16S rDNA序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST相似性分析，查詢與菌株相近的16S rDNA序列，利用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DPS軟件對(duì)X0與Xi進(jìn)行數(shù)據(jù)量化處理，得到4株放線菌菌株與參考菌株的關(guān)聯(lián)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌菌株的初篩

根據(jù)抑菌半徑的大小，初步篩選到對(duì)3種病原菌抑菌效果均較好的4個(gè)菌株，見(jiàn)表1。

2.2 拮抗放線菌菌株對(duì)小麥紋枯病、根腐病的防治效果

圖1表明，菌株FX-H-51對(duì)禾谷絲核菌引起的小麥紋枯病的防治效果最好，達(dá)到81.20%；菌株FX-S-178對(duì)黃色鐮孢菌引起的小麥根腐病防治效果最好，達(dá)到76.53%。單個(gè)菌株仍是菌株FX-H-51對(duì)平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病防治效果最好。兩兩組合的菌株處理表現(xiàn)都不理想。菌株FX-H-51、FX-H-71、FX-S-178組合對(duì)平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病防治效果最好，達(dá)到75.10%。三個(gè)菌株組合的處理提高了對(duì)蠕孢菌的控制效果，但沒(méi)有提高其對(duì)黃色鐮孢菌和禾谷絲核菌的控制效果。

2.3 拮抗放線菌菌株的綜合評(píng)價(jià)

以4株放線菌菌株對(duì)峙WK207的抑菌半徑及耐性測(cè)定結(jié)果為指標(biāo)構(gòu)建參考菌株（表2）。

表3表明，菌株FX-H-51的綜合性狀與參考菌株的灰色關(guān)聯(lián)度值最高，是比較理想的抗病抗逆放線菌菌株。

2.4 菌株FX-H-51的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

菌株FX-H-51在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)繁茂，邊緣不規(guī)則向四周擴(kuò)散，呈橙紅色，表面絨狀隆起且干燥不透明。氣絲直桿狀，淺粉色，基絲橙紅色，無(wú)橫隔，孢子橢圓形，表面光滑（圖2）。菌株FX-H-51能使明膠全部液化，牛奶凝固且胨化，能夠水解淀粉跟纖維素，但水解纖維素能力較弱，硝酸鹽不還原，不產(chǎn)生硫化氫（圖3）。

2.5 菌株FX-H-51的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株FX-H-51的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條1 447 bp的條帶（圖4），之后克隆測(cè)序得到菌株FX-H-51的16S rDNA序列，通過(guò)比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）可以看出，菌株FX-H-51與海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis，基因登錄號(hào)為KC737552.1）的16S rDNA序列同源性最高，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚于同一分支中。

根據(jù)以上形態(tài)特征和生理生化特性，F(xiàn)X-H-51符合鏈霉菌屬的相關(guān)特征；進(jìn)一步由16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果，最終確定該菌株為海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis） 。

3 討論與結(jié)論

灰色關(guān)聯(lián)度分析法是對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行綜合描述和量化評(píng)估的一種有效方法，能夠全面、客觀地評(píng)價(jià)每個(gè)菌株的表現(xiàn)，克服了方差分析或回歸分析等方法中僅考慮抑制率一個(gè)因素而使某些綜合性狀較好的菌株被埋沒(méi)的弊端。本研究利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，對(duì)4株抑菌效果較好的放線菌菌株進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，這將為篩選高效生防菌株提供借鑒。

小麥土傳病害是嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量的根部病害，化學(xué)防治是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最主要的防治方法。放線菌資源豐富，近年來(lái)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已有越來(lái)越多的應(yīng)用，尤其是鏈霉菌在生物防治方面也有大量發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。魏曉麗等[16]從青藏高原分離得到的4株放線菌均能明顯提高棉花幼苗整株和根系鮮重。Evangelista-Martinez等[17]從土壤中分離了一株放線菌，其對(duì)黑曲霉、長(zhǎng)蠕孢菌等的抑菌率為47%～90%。申屠旭萍等[18]對(duì)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌進(jìn)行研究表明，其代謝產(chǎn)物豐加霉素對(duì)黃瓜枯萎病、菜豆炭疽病、番茄灰霉病等致病菌有很好的拮抗作用。目前利用鏈霉菌防治小麥土傳病害的報(bào)道相對(duì)較少。本研究從116株放線菌中篩選出一株具有較好耐受性的高效生防放線菌FX-H-51，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果，確定該菌株為海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis） 。放線菌菌株FX-H-51對(duì)小麥紋枯病及根腐病的生防效果較好，具有良好的開(kāi)發(fā)潛力，為進(jìn)一步應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Coombs J T， Franco C M M.Visualization of an endophytic Streptomyces species in wheat seed[J].Appl.Environ.Microbiol，2003， 69（7）： 4260-4262.

[2] 陳杰，湯琳，郭天文，等. 馬鈴薯土傳病原真菌拮抗放線菌的抗病促生作用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2014，42（1）： 111-119.

[3] Francisco R E ，Chataigné G，Raoelison G，et al. Characterization of an endophytic whorl-forming Streptomyces from Catharanthus roseus stems producing polyene macrolide antibiotic[J]. Revue Canadienne De Microbiologie， 2012，58（5）：617-627.

[4] 張武崗. 放線菌19G-317菌株及其代謝產(chǎn)物抑菌活性研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2009.

[5] Thumar J T，Dhulia K，Singh S P. Isolation and partial purification of an antimicrobial agent from halotolerant alkaliphilic Streptomyces aburaviensis strain kut-8[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26（11）：2081-2087.

[6] 季蕾. 禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）rDNA-ITS序列異質(zhì)性分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

[7] 李燕，張玉鳳，林海濤，等. 木醋液對(duì)小麥根腐病致病菌及小麥發(fā)芽的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（4）：96-99，111.

[8] 陳丹，葉波，劉燕娟，等. 水稻紋枯病菌拮抗菌CZB40的篩選、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 植物保護(hù)，2015，41（5）：46-53.

[9] 徐文鳳. 環(huán)渤海灣地區(qū)重茬蘋果園土壤真菌群落多樣性及生防真菌的篩選[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[10]徐文鳳， 毛志泉， 孫海濤， 等. 灰色關(guān)聯(lián)度分析法在拮抗絲核菌木霉菌株篩選中的應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2012， 43（2）： 189-192，196.

[11]?，|，王娟，陳吉寶，等. 玉米幾種病害抗病性與單株粒重灰色關(guān)聯(lián)度分析[J]. 作物雜志， 2015（5）：41-45.

[12]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組編著. 鏈霉菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社， 1975.

[13]周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1986.

[14]徐平， 李文均， 徐麗華， 等. 微波法快速提取放線菌基因組DNA[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2003（4）： 82-84.

[15]姜淑梅， 張龍， 戴世鯤， 等. 一種簡(jiǎn)單、有效的適于PCR操作的放線菌DNA提取方法[J]. 生物技術(shù)， 2007（1）：39-41.

[16]魏曉麗，陳杰，何斐，等. 拮抗鏈霉菌對(duì)棉花幼苗光合和生長(zhǎng)的影響及其在棉花根內(nèi)的定殖[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，41（9）：78-84，90.

[17]Evangelista-Martinez Z. Isolation and characterization of soil Streptomyces species as poten-tial biological control agents against fungal plant pathogens[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2014， 30（5）：1639-1647.

[18]申屠旭萍， 于冰， 邊亞琳，等. 拮抗鏈霉菌B28的分類鑒定及其生防作用研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2012，42（1）：105-109.