楊云朧　牛秋紅

摘 要：目的：分離和鑒定結(jié)晶紫脫色菌。方法：從采集水樣中分離篩選到一株三苯甲烷類染料結(jié)晶紫降解菌WL7，通過培養(yǎng)、形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列同源性比較進(jìn)行鑒定，研究在不同接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH和培養(yǎng)時(shí)間下菌株WL7對(duì)結(jié)晶紫的脫色性能。結(jié)果：菌株WL7被鑒定為一株節(jié)桿菌（Arthrobacter rhombi WL7），對(duì)結(jié)晶紫具有較高的脫色能力，結(jié)晶紫含量為20 mg/L時(shí)，最高脫色率可達(dá)88.9%。結(jié)論：在結(jié)晶紫廢水的處理領(lǐng)域WL7具有潛在的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：結(jié)晶紫；脫色；分離；16S rDNA序列

中圖分類號(hào) X703 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）02-0028-04

Abstract：Objective：To isolate and identify crystal violet decoloring bacteria.Method：Cultural，morphological，physiological and biochemical and 16S rDNA sequence characteristics were applied to confirm the classification of isolation strains.Preliminary study on different inoculation size，culture temperature，initial pH and culture time of strain WL7 on crystal violet decolorization performance were performed.Result：A bacterial strain WL7 capable of decolorizing triphenylmethane dyes crystal violet was isolated from the collected water samples.WL7 was identified as Arthrobacter rhombi.WL7 have high decolorization ability on crystal violet of 20 mg/L，the highest decolorization rate is 88.9%.Conclusion：WL7 has potential application prospect in the treatment of crystal violet wastewater.

Key words：Crystal violet；Decolorization；Isolation；16S rDNA sequence

結(jié)晶紫是一類難以降解且對(duì)許多生物都具有致癌、致畸性的三苯甲烷類染料[1-2]，廣泛應(yīng)用于油墨、紙張、印染、制革和紡織等行業(yè)[3]，產(chǎn)生了大量高色度的染料廢水，引起嚴(yán)重的水體和土壤污染[4]。目前水體中染料去除的主要方法有物理脫色法、化學(xué)脫色法[5，6]和生物脫色法[7-11]。物理和化學(xué)法見效快，成本高，易引起二次污染，其使用一直受到制約[12]。生物脫色法被視為一種環(huán)境友好型的方法[12-13]，主要包括吸附和降解脫色2種類型[10]，具有成本低、效率高等特點(diǎn)，越來(lái)越受到科研人員的青睞。理化方法處理三苯甲烷染料廢水效果不理想，高濃度的三苯甲烷染料也抵抗微生物的礦化，因此尋找高效的三苯甲烷染料脫色菌已成為研究焦點(diǎn)，并對(duì)脫色方式及機(jī)理進(jìn)行了大量研究[14-17]。本文以結(jié)晶紫為目標(biāo)染料，分離并鑒定了一株結(jié)晶紫脫色菌WL7，并對(duì)其脫色機(jī)理和脫色性能進(jìn)行了初步研究，旨在為三苯甲烷類染料染料的生物脫色方法及其在生產(chǎn)實(shí)際中的潛在應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 樣品采集自南陽(yáng)市臥龍區(qū)某印染廠廢水池上層水樣。結(jié)晶購(gòu)于紫天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；蛋白胨和牛肉膏購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂購(gòu)于美國(guó)Sanland公司；無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)于萊陽(yáng)市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備 精密電子天平（JJ300型，常熟雙杰儀器廠）；恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9160型，上海一恒科技公司）；Nikon E-600微分干涉顯微鏡；離心機(jī)（DSX-280B型，上海申安醫(yī)療器械廠）；恒溫振蕩器（THZ-928型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；紫外及可見分光光度計(jì)（Evolution 600 BB型，英國(guó)熱電公司）。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其具體配方及配制方法見參考文獻(xiàn)[18]，其中固體培養(yǎng)基瓊脂含量為1.5%，富集和篩選培養(yǎng)基中結(jié)晶紫濃度均為20mg/L。

1.3.2 菌株富集和篩選 將從印染廠采集的染料廢水取5mL接種于45mL富集培養(yǎng)液中在35℃、150r條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察，取5mL脫色的富集培養(yǎng)物繼續(xù)接種到45mL富集培養(yǎng)液中同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至脫色，挑取脫色液劃線到含結(jié)晶紫的固體培養(yǎng)基上，于恒溫箱內(nèi)35℃培養(yǎng)至菌落產(chǎn)生，挑選菌落周圍出現(xiàn)顯著脫色區(qū)的菌落繼續(xù)劃線純化獲取單菌落，并對(duì)其進(jìn)行單染色，用Nikon E-600微分干涉顯微鏡進(jìn)行鏡檢。

1.3.3 分離菌株的鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的操作方法，對(duì)分離菌株的培養(yǎng)、形態(tài)及生理生化特征進(jìn)行檢測(cè)[19]；16S rDNA序列測(cè)定的測(cè)定委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。將獲得的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行同源性比較，選取同源性較高的16S rDNA序列，采用軟件Clustalw2.0.10進(jìn)行多序列匹配排列后MEGA6.05軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 分離菌株脫色性能的研究 菌株WL7接種于含50mL牛肉高蛋白胨液體培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，于35℃，150r培養(yǎng)24h制備種子液。以5%的接種量、轉(zhuǎn)速150r、35℃、初始pH7和培養(yǎng)時(shí)間24h為基礎(chǔ)條件，分別研究菌株WL7在不同接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)結(jié)晶紫的脫色效率，設(shè)置3個(gè)平行，定時(shí)取樣，測(cè)吸光值。

1.3.5 脫色率檢測(cè) 取培養(yǎng)液以8000r離心5min，在結(jié)晶紫最大吸收波長(zhǎng)589nm處測(cè)量上清液的吸光值，以不接菌染料溶液為對(duì)照，結(jié)果取3個(gè)平行平均值計(jì)算脫色率[20]。以脫色率來(lái)表示菌株WL7對(duì)結(jié)晶紫的脫色能力：

脫色率（%）=（A0-At）/A0×100

式中：A0表示不接菌溶液的吸光值，At表示接菌t時(shí)間時(shí)溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 染料脫色菌的分離 對(duì)采集的染料廢水進(jìn)行富集培養(yǎng)，選擇脫色程度大及脫色時(shí)間短的培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行富集培養(yǎng)，脫色培養(yǎng)物劃線含結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨平板35℃培養(yǎng)，24h時(shí)選擇周圍形成明顯的脫色圈的菌落繼續(xù)劃線分離純化，獲得一株染料脫色菌WL7。在牛肉膏蛋白胨平板上WL7菌落圓形隆起，呈乳白色，不透明，邊緣整齊，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，無(wú)芽胞。

2.2 菌株WL7的生理生化特征 菌株WL7的生理生化特征見表1。從表1可以看出，菌株WL7接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，氧化葡萄糖不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；硝酸鹽還原、V.P.試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)及硫化氫試驗(yàn)均為陰性?？梢岳霉?、蔗糖、阿拉伯糖等多數(shù)碳源，不能利用棉籽糖和山梨醇。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，菌株WL7的生理生化特征與節(jié)桿菌屬細(xì)菌高度相似[19]。

2.3 菌株WL7的分子鑒定 菌株WL7的16S rDNA的測(cè)序結(jié)果為1410個(gè)核甘酸，行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的12株菌的16S rDNA序列匹配排列后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），從圖1可以看出，菌株WL7與節(jié)桿菌屬的多株細(xì)菌同源性較高，與節(jié)桿菌（Arthrobacter rhombi）處于同一分支，因此結(jié)合生理生化特征初步把菌株WL7鑒定為一株節(jié)桿菌（Arthrobacter rhombi WL7）。株WL7與節(jié)桿菌屬的多株細(xì)菌同源性較高，與節(jié)桿菌（Arthrobacter rhombi）處于同一分支，因此結(jié)合生理生化特征初步把菌株WL7鑒定為一株節(jié)桿菌（Arthrobacter rhombi WL7）。

2.4 菌株WL7的脫色性能

2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脫色效果的影響 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)脫色效果的影響見圖2。由圖2可知，接種量為5%，培養(yǎng)條件為35℃、150r、初始pH7時(shí)，24h的脫色率為81.3%；36h的脫色率即可達(dá)到85.6%，其后脫色率緩慢增加，72h的脫色率即可達(dá)到88.9%。培養(yǎng)至24h期間脫色率呈指數(shù)增長(zhǎng)，其后脫色率相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)顯著的提高，因此下述實(shí)驗(yàn)均考察24h的脫色率來(lái)比較菌株WL7的脫色性能。

2.4.2 接種量對(duì)降解效果的影響 從圖3可以看出，培養(yǎng)24h接種量對(duì)脫色效果影響較大，接種量也大，培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的脫色率越高。當(dāng)接種量為1%～5%時(shí)，脫色率升高較快，當(dāng)接種量高于7%后，脫色率均在87.3%以上，接種量對(duì)脫色率的影響趨于變小。接種量與脫色率呈正相關(guān)表明在培養(yǎng)24h內(nèi)，接種量越大，菌體生長(zhǎng)越迅速，延滯期越短，脫色效果越明顯。

2.4.3 溫度對(duì)降解效果的影響 考察了15～50℃范圍內(nèi)溫度對(duì)脫色效率的影響，從圖4可以看出，溫度對(duì)脫色率的影響較大。溫度為30℃時(shí)，24h的脫色率最高，可達(dá)到84.5%。15～30℃范圍內(nèi)，脫色率逐步提高，30～40℃范圍內(nèi)，脫色率逐步降低，45℃和50℃脫色率急劇降低，這可能是由于高溫過高對(duì)菌株WL7生長(zhǎng)有抑制作用，導(dǎo)致生物量過，也可能溫度過高影響降解結(jié)晶紫的酶的活性，因而影響脫色效果。溫度為20℃時(shí)，24h的脫色率仍可達(dá)到70%以上，表明菌株WL7對(duì)自然水體中結(jié)晶紫的去除有較大的潛在應(yīng)用前景。

2.4.4 初始pH對(duì)脫色效果的影響 初始pH對(duì)脫色效果的影響如圖5。由圖5可知，初始pH對(duì)脫色效果影響也較大。初始pH為5和9時(shí)脫色率相對(duì)較低，pH為5時(shí)，脫色率脫色率僅為63.2%，初始pH在中性范圍附近，24h的脫色率相對(duì)較高，pH為7時(shí)，脫色率脫色率達(dá)到最高，為81.7%。

3 討論

從采集水樣中分離得到一株三苯甲烷類染料結(jié)晶紫降解菌WL7，初步鑒定為一株節(jié)桿菌（Arthrobacter rhombi）。在不同接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH和培養(yǎng)時(shí)間下菌株WL7對(duì)結(jié)晶紫表現(xiàn)不同的脫色性能。菌株WL7在較高的溫度和初始pH范圍均有顯著的脫色作用，當(dāng)結(jié)結(jié)晶紫含量為20mg/L時(shí)，最高脫色率可達(dá)88.9%，因此在結(jié)晶紫工業(yè)廢水的處理過程中具有潛在的應(yīng)用前景，菌株WL7的脫色機(jī)理及脫色最佳工藝參數(shù)尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]都林娜，葉曙光，李剛，等.結(jié)晶紫高效脫色菌株的篩選、鑒定與脫色特性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：378-381.

[2]任隨周，郭俊，王亞麗，等.細(xì)菌脫色酶TpmD對(duì)三苯基甲烷類染料脫色的酶學(xué)特性研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，46（3）：385-389.

[3]譙建軍，田萍，姚秉華，等.染料結(jié)晶紫降解菌分離及其特性研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2006，7（2）：62-65.

[4]李琛琛，凌琪，王莉，等.Sphingomonas sp.SJ-1對(duì)染料結(jié)晶紫的降解脫色特性[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，14（6）：165-168.

[5]劉兵，汪家權(quán)，張發(fā)宇，等.光催化氧化與內(nèi)電解法降解有機(jī)染料廢水的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（22）：10653-10655.

[6]Faiza Rehman，Sayed Murtaza，Javed Ali Khan，et al.Removal of crystal violet dye from aqueous solution by gamma irradiation[J].Journal of the Chilean Chemical Society，2017，62：3359-3364.

[7]江瑩，桂震，齊杭杭，等.一株腐敗希瓦氏菌的篩選鑒定及其染料脫色研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（23）：224-228.

[8]李凡姝，劉海洋，范麗莉，等.菌株Bacillus sp.CLb芽孢漆酶對(duì)染料、模擬染料廢水脫色的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（15）：4569-4572.

[9]尹立偉，楊春成，池玉杰.猴頭菌CB1染料脫色及其相關(guān)木質(zhì)素降解酶的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（09）：250-253，256.

[10]董振，劉亮，郝艷，等.偶氮染料廢水處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J].水處理技術(shù)，2017（4）：6-10.

[11]Daniela Chmelová，Miroslav Ondrejovi c.Purification and characterization of extracellular laccase produced by Ceriporiopsis subvermispora and decolorization of triphenylmethane dyes[J].Journal of Basic Microbiology，2016，56（11）：1173-1182.

[12]張曉華，趙保衛(wèi)，任學(xué)昌，等.一種三苯甲烷類染料脫色菌液的制備及其脫色性能[J].中國(guó)給水排水，2016（9）：98-102.

[13]王天廣.活性紅KE-3B的厭氧脫色研究[D].鄭州：河南大學(xué)，2012.

[14]譙建軍.三苯甲烷類染料廢水微生物降解研究[D].西安：西安理工大學(xué)，2005.

[15]Jingfei Luan，Yue Shen.Biodegradation of crystal violet with glyoxal oxidase as biocatalyst and further degradation of crystal violet with polythiophene-Gd2FeSbO7 as photocatalyst[J].Journal of Biotechnology，2016，231：S108.

[16]張曉昱，顏克亮，王宏勛.稻草稈粉基質(zhì)中白腐菌對(duì)三苯甲烷類染料的降解特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2006，12（2）：255-258.

[17]司靜，崔寶凱，戴玉成.東方栓孔菌在染料脫色中的應(yīng)用及其脫色條件的優(yōu)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30（3）：364-371.

[18]沈萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，2007.

[19]蔡妙英，東秀珠.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[20]胡起靖，林玉滿，甘莉，等.一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對(duì)結(jié)晶紫的脫色條件研究[J].福建師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，24（2）：75-79.

（責(zé)編：張宏民）