董蓮華， 王 晶， 傅博強(qiáng)， 段宇航， 隋志偉(中國計量科學(xué)研究院， 北京 100029)

1 引 言

KRAS位于12號染色體，正常的KRAS基因參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變時，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號傳遞紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長不能自我凋亡而引發(fā)癌變。在腫瘤患者中檢測出的最常見的突變是位于KRAS基因的12、13號密碼子的突變[1]。KRAS基因突變通常會發(fā)生在胰腺癌和結(jié)直腸癌形成的早期[2,3]。目前，檢測KRAS突變的方法包括：基于測序技術(shù)的Sanger測序法和下一代測序法(next generation sequencing, NGS)，基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)技術(shù)的ARMS-PCR(amplification-refractory mutation system，ARMS)、突變富集PCR[6]和COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR)。而這些方法的特異性和靈敏度有很大差異。如Sanger測序測定等位基因突變的靈敏度為20%左右[5]；下一代測序方法的靈敏度為5%左右[5]； ARMS-PCR方法的靈敏度在1%[6]；而突變富集PCR和COLD-PCR的靈敏度可達(dá)到0.1%[7,8]。數(shù)字PCR用于等位基因突變檢測的分析靈敏度為0.05%～0.1%，甚至更高[9]。雖然對各種檢測KRAS基因突變方法的報道較多，但關(guān)于不同方法之間的可比性卻少有報道。

本研究的目的是建立基于數(shù)字PCR和NGS技術(shù)的KRAS基因突變檢測方法，利用含有KRAS基因突變的細(xì)胞系來配置不同突變比例的樣本，考察所建立的2種方法的可比性，以期為臨床檢測中應(yīng)用這些方法時提供參考。

2 實驗部分

2.1 細(xì)胞系

A549(ATCC? CRM-CCL-185TM)為攜帶G12S突變的純合突變細(xì)胞，NCI-H157為攜帶G12R突變型的雜合突變細(xì)胞。含有野生型KRAS基因的293T細(xì)胞系作為陰性材料，用于配置含有不同突變比例的樣本。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549的培養(yǎng)基為 90%的杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(DMEM)和10%的胎牛血清(FBS)；培養(yǎng)條件：在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃，培養(yǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部面積達(dá)到80%～90%時按1:3比例傳代。NCI-H157的培養(yǎng)基為90% 1640(培養(yǎng)基)+10%FBS；培養(yǎng)條件：在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃，培養(yǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部面積達(dá)到80%～90%時按1:3比例傳代。293T細(xì)胞培養(yǎng)液類型為90%DMEM+10%FBS培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃，培養(yǎng)的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部面積達(dá)80%～90%時傳代，按1:4至1:5比例傳代。

2.3 不同突變比例的細(xì)胞樣品的制備

2.3.1 收集細(xì)胞

NCI-H157，A549和293T細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，使用貼壁細(xì)胞收集方法。將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸出，每個培養(yǎng)皿中加入2 mL胰酶，晃動培養(yǎng)皿，待充分接觸細(xì)胞后，將培養(yǎng)皿放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化90 s～2 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變圓即可；取出培養(yǎng)皿，加入適當(dāng)培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中離心，800 r/min離心8 min，棄上清，加入適當(dāng)磷酸鹽緩沖液，重懸細(xì)胞；然后再離心，800 r/min離心8 min離心棄上清，洗去培養(yǎng)液和胰酶；向離心后的細(xì)胞內(nèi)加入10 mL的磷酸鹽緩沖液，重新懸浮細(xì)胞得到細(xì)胞懸液。

2.3.2 細(xì)胞計數(shù)

取3支1.5 mL的離心管，分別加入900 μL的磷酸鹽緩沖液，再從上述細(xì)胞懸液中分別吸取100 μL細(xì)胞液至3個離心管內(nèi)，將細(xì)胞混勻，用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。分別計算3個離心管內(nèi)的細(xì)胞濃度，然后計算出每個細(xì)胞系的平均濃度。結(jié)果A549細(xì)胞濃度為8.49×106個/mL，293T細(xì)胞濃度為1.92×107個/mL，NCI-H157細(xì)胞濃度為1.69×107個/mL。

2.3.3 細(xì)胞配比混合

混合好的2種細(xì)胞的總數(shù)約為4×107個細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)計算出的細(xì)胞濃度，加入相應(yīng)體積的細(xì)胞液進(jìn)行混合。A549和293T混合成含有G12S不同突變比例的細(xì)胞樣品見表1。NCI-H157與293T混合成含有G12R不同突變比例的細(xì)胞樣品見表2。

表1 G12S不同突變比例的細(xì)胞溶液配制表

表2 G12R不同突變比例的細(xì)胞溶液配置表

2.4 數(shù)字PCR法

2.4.1 引物探針設(shè)計

本研究中選擇了KRAS基因常見的突變型G12S和G12R，分別是12號染色體的25398285位置處的堿基由原來的G突變成了C(G12R)和T(G12S)，從而導(dǎo)致由原來GGT編碼的甘氨酸(Gly，G)分別變成了精氨酸(Arg，R)和絲氨酸(Ser，S)，因此2個對應(yīng)突變型分別標(biāo)記為G12R和G12S。

根據(jù)選擇的對應(yīng)的突變型的序列信息，按照引物探針設(shè)計原則，使用軟件設(shè)計引物探針序列。上游引物：CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTA；下游引物：TGAAAATGGTCAGAGAAACCTTTA。野生型探針序列：VIC-tggagctGgtggcgt-MGB；G12R突變探針序列：FAM-tggagctCgtggcgt-MGB；G12S突變探針序列：FAM-ttggagctAgtggcgta-MGB。

2.4.2 PCR擴(kuò)增條件及特異性檢測

采用數(shù)字PCR方法測定不同突變比例的細(xì)胞樣品是在芯片式數(shù)字PCR儀(BioMark，F(xiàn)luidigm)上完成。對于突變比例高于1%的樣品，采用48×770的芯片進(jìn)行測定(每個Partition可以加入0.65 μL樣品)；而突變比例低于1%的樣品，由于考慮到突變基因拷貝數(shù)太低，需要加大上樣量，因此采用12×765的芯片(每個盤可以加入4.59 μL樣品)進(jìn)行測定。使用12×765的芯片，擴(kuò)增的體系為10 μL，其中含上下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，探針(10 μmol/L)0.1 μL，2.5×PCR master mix (16 S Dye，Molzym) 4 μL，DNA聚合酶(16 S Dye，Molzym)0.2 μL，GE loading (Fluidigm)0.5 μL，ROX染料 0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增條件為95 ℃，10 min，45個循環(huán)(包括95 ℃，15 s；60 ℃，40 s)。使用48×770的芯片時，所有的擴(kuò)增試劑成分和濃度與上述相同，只是擴(kuò)增體系降低至5 μL。

選擇了7個具有常見KRAS基因突變型的DNA樣本作為DNA模板，使用實時熒光定量PCR儀(LightCycler480，Roche)進(jìn)行G12R和G12S PCR擴(kuò)增特異性分析。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中含有上下游引物(10 μmol/L)1 μL，探針(10 μmol/L)0.2 μL，2×PCR master mix 4 μL(Gene Expression，Thermo Fisher)，用ddH2O補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃，10 min，40個循環(huán)(包括95 ℃，15 s；60 ℃，40 s)。

2.5 下一代測序法

采用通用型柱式基因組提取試劑盒(康為世紀(jì))將含一定突變比例的細(xì)胞樣品提取基因組DNA，具體操作見試劑盒說明書。得到基因組DNA通過PCR擴(kuò)增KRAS基因片段200 bp (base pair)，擴(kuò)增體系為50 μL，上下游引物(1 μmol/L) 各1 μL，5×HF buffer，dNTP (2.5 mmol/L)加入4.8 μL，DNA模板100 ng，Phusion超保真DNA聚合酶1 μL，水補(bǔ)足50 μL。使用的PCR程序為：98 ℃，2 min；35個循環(huán)：98 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，30 s；72 ℃，5 min。第一輪PCR程序結(jié)束后，進(jìn)行第二輪PCR程序，即連接測序接頭，第二輪PCR程序體系與第一輪相同，擴(kuò)增程序一致，但將循環(huán)數(shù)為15個。上述2輪PCR后得到的文庫采用磁珠法進(jìn)行純化，采用Qubit測定濃度，將已構(gòu)建完成的文庫稀釋至1.5 ng/μL，進(jìn)行上機(jī)測序。用實時熒光定量PCR方法(Light Cycler，Roche)對純化后的文庫進(jìn)行定量，根據(jù)定量結(jié)果確定上機(jī)時所需文庫量。使用NextSeq500(Illumina)進(jìn)行測序。

3 結(jié)果與討論

3.1 基因突變型的確定

為驗證所使用的細(xì)胞系是否含有目標(biāo)突變型以及是否為預(yù)期的純合度，將培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行DNA提取和純化后進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果見圖1。圖1中A5491為培養(yǎng)后用于配制不同不變比例的細(xì)胞樣品；A5492為凍存在液氮中的細(xì)胞。用于配制不同突變比例的野生型細(xì)胞293T經(jīng)過Sanger測序驗證后證明在chr12-25398285位置處為野生型，且沒有其它信號峰，表明該細(xì)胞系為純合野生型。NCI-H157經(jīng)過Sanger測序后確認(rèn)在chr12-25398285位置同時有G和C的信號，且2個峰的峰高相近，表明此位置處為雜合突變。

A549的Sanger測序結(jié)果表明在chr12-25398285位置的主峰是T, 見圖1中的A5491，即由原來野生型C突變成了T(此突變記為：T>C)，但此位置同時還有一個野生型堿基C的小峰，且2個峰高相差較大。如果A549細(xì)胞是雜合，2個峰的峰高應(yīng)該接近，因此推測導(dǎo)致這一野生型堿基峰出現(xiàn)的原因可能是在A549細(xì)胞培養(yǎng)或基因組DNA提取過程中混入了野生型細(xì)胞或DNA。為進(jìn)一步證明該推測，采用NGS對其進(jìn)行了驗證。NGS驗證結(jié)果表明A549含有83.41%的G12S突變型，同時還含有16.59%的野生型。

圖1 Sanger測序法對細(xì)胞系突變型的驗證結(jié)果

同時又對凍存在液氮中的A549細(xì)胞重新活化后，提取DNA進(jìn)行Sanger測序驗證(圖1中的A5492)，此次測序的結(jié)果A549為純合突變，沒有任何雜峰，因此證明第一次測序的A549樣品中的確是由于混入了野生型DNA而導(dǎo)致了相應(yīng)位置上野生型堿基峰的出現(xiàn)。但配置不同比例的細(xì)胞混合液時使用的是第一次測序的A549樣品，因此使用該樣品配制G12S不同突變比例的細(xì)胞溶液時需要考慮其純度對配制值的影響。

3.2 PCR方法特異性

將7個具有常見KRAS基因突變型的樣本DNA作為模板，采用G12R定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到的結(jié)果見圖2。圖2中，含有G12R突變(此突變記為：G>C)的細(xì)胞系NCI-H157樣品得到了PCR擴(kuò)增曲線，對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為26.37，而其它6個未含有該突變的樣品沒有得到相應(yīng)的 PCR擴(kuò)增曲線或擴(kuò)增非常延遲(30個循環(huán)以內(nèi)沒有擴(kuò)增)，可見該方法對相同位點不同突變的基因沒有非特異性擴(kuò)增，而對目標(biāo)突變的擴(kuò)增特異性良好，可用于特異檢測G12R突變。

圖2 G12R定量PCR方法擴(kuò)增結(jié)果

將上述7個樣本的DNA作為模板，進(jìn)行G12S的PCR擴(kuò)增特異性分析，擴(kuò)增曲線見圖3。由圖3可知，含有G12S突變(此突變記為：G>A)的細(xì)胞系A(chǔ)549樣品得到了PCR擴(kuò)增曲線，對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為25.47，而其它6個未含有該突變的樣品沒有得到相應(yīng)的 PCR擴(kuò)增曲線，可見該方法對相同位點不同突變的基因沒有非特異性擴(kuò)增，而對目標(biāo)突變的擴(kuò)增特異性良好，可用于特異檢測G12S突變。

圖3 G12S定量PCR方法擴(kuò)增結(jié)果

3.3 數(shù)字PCR方法測定結(jié)果

基于建立的數(shù)字PCR方法對配制的2個不同突變型，每個突變型的5個不同突變比例的細(xì)胞樣品進(jìn)行測定。每個突變水平取5個樣品，每個樣品重復(fù)測定3次，G12R和G12S測定結(jié)果見表3。表3中的SD為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差； 理論值突變豐度±SD為基于細(xì)胞計數(shù)的配制值基礎(chǔ)上修正了突變型細(xì)胞純度；p值為T檢驗的概率值。 對于未與野生型細(xì)胞混合的G12S-5和G12R-5這2個樣品，數(shù)字PCR測定的結(jié)果分別為87.63%和39.59%，這與Sanger測序方法驗證的結(jié)果一致，A549樣品中在配制前混入了野生型細(xì)胞而導(dǎo)致了突變基因含量的測定結(jié)果低于100%。而NCI-H157為G12R雜合突變，但數(shù)字PCR測定的G12R突變基因含量也低于50%，基于細(xì)胞計數(shù)的配制值與數(shù)字PCR方法測定值不一致的原因可能是2種突變型細(xì)胞在配制前已經(jīng)混有野生型細(xì)胞，因此基于細(xì)胞計數(shù)的突變比例配制值需要對細(xì)胞純度進(jìn)行修正，而細(xì)胞純度參考了NGS測定結(jié)果進(jìn)行修正。

數(shù)字PCR方法對突變比例高于1%的樣品(G12S-3，G12S-4，G12S-5，G12R-3，G12R-4和G12R-5)的測定結(jié)果的重復(fù)性，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示為RSD<10%，測定結(jié)果與修正后的配制值相比，無顯著差異。而對于突變比例低于1%的樣品(G12S-1，G12S-2，G12R-1和G12R-2)的測定結(jié)果的重復(fù)性較差，RSD在16%～34%。原因是對于低突變比例樣品，由于突變基因的拷貝數(shù)濃度太低，為保證野生型基因不超出12×765芯片的所能負(fù)荷的最大范圍(即765個反應(yīng)小室內(nèi)最多有一個為陰性)，加入每個小室的DNA分子數(shù)目不能超過5 000拷貝，而此時芯片中每個小室的目標(biāo)突變基因拷貝數(shù)(以突變率在0.02%～0.60%計算，即每個小室的突變基因拷貝數(shù)在1～30個)在0.001～0.040拷貝/小室，這個值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于數(shù)字PCR所能達(dá)到的精密度最好時的值(1.59拷貝/小室)[10，11]，因此在對突變基因豐度低至0.02%～0.60%的樣品定量時，數(shù)字PCR方法的重復(fù)性較差。盡管如此，對于低豐度突變基因的測量，數(shù)字PCR方法仍然可以準(zhǔn)確測定出G12S低至0.02%的突變比例，這個檢測靈敏度優(yōu)于Azuara等[9]報道的使用相同儀器測定KRAS基因突變時的靈敏度0.05%。

表3 突變豐度測定結(jié)果

3.4 NGS方法測定結(jié)果

采用下一代測序方法對不同突變比例的樣品進(jìn)行測定，每個水平的樣品進(jìn)行4次重復(fù)建庫后測得結(jié)果見表3。對于G12S-5和G12R-5這2個未與野生型細(xì)胞混合的樣品，NGS測定突變基因比例分別為83.39%和36.89%，這個結(jié)果與Sanger測序結(jié)果相符合。NGS對于突變頻率高于1%的樣品(G12S-3，G12S-4，G12S-5，G12R-3，G12R-4和G12R-5)的測定結(jié)果與理論值相比較無顯著差異。

NGS測定的G12S-2樣品的結(jié)果為1.17%，與理論值相比無明顯差異。而G12R-2樣品的測定結(jié)果(0.67±0.05)%與理論值相比顯著偏高。NGS測定的突變比例低于0.1%的樣品(G12S-1和G12R-1)的測定結(jié)果與理論值相比差異顯著。而且在前2次重復(fù)中NGS方法并未檢測出突變，而在后續(xù)的2次重復(fù)中隨著測序深度的增加，可以檢測出突變型了，但是測定結(jié)果仍與理論值差距較大，這表明該突變比例已經(jīng)完全超出了NGS所能測定出的突變水平，而多數(shù)報道指出NGS所能測定突變比例一般為5 %[5]，本研究中所建立的NGS方法將測序深度增加至105數(shù)量級，可以檢測低至1 %左右的突變。

3.5 2種方法的可比性

對NGS和數(shù)字PCR這2種方法的測定結(jié)果，采用T檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)差異顯著性判斷，分析結(jié)果見表3。對于突變比例≥0.83%的樣品，NGS和數(shù)字PCR這2種方法的測定結(jié)果均沒有顯著差異(p>0.05)。而對于突變比例低于0.83 %的樣品(G12S-1,G12R-1,G12R-2)，2種方法的測定結(jié)果差異顯著(p<0.05)。

4 結(jié) 論

從NGS幾次重復(fù)測定結(jié)果可以看出本研究中所建立的針對KRAS基因突變的NGS方法的最低檢測突變比例約為1%，當(dāng)突變比例等于或高于NGS方法的測定靈敏度時，數(shù)字PCR方法和NGS方法的測量結(jié)果可比，而當(dāng)突變比例低于NGS方法的測定靈敏度時，數(shù)字PCR方法和NGS方法的測量結(jié)果不可比。

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