張 旭，張 蕾，馬媛媛

(1、甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730030 2、蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，蘭州 730030)

山楂收錄于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部，是薔薇科山楂屬植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.major N. E. Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果實(shí)，具有消食化積，行氣散瘀之功效[1]。另有山楂葉的記載，其葉片亦具有活血化瘀，理氣通脈、化濁降脂之功效[2]。山楂中含有黃酮類、有機(jī)酸類等多種成分[3-4]，不同樣品間各成分含量相差較大[5]。目前已從中分離得到了金絲桃苷、槲皮素、牡荊素、蘆丁等多種成分[6]。同時(shí)山楂也作為一種飼料添加劑廣泛應(yīng)用在畜牧業(yè)中，發(fā)揮著提高飼料蛋白質(zhì)、脂肪的消化率，降低飼料消耗，防治疾病，提高成活率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的作用[7]，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。因此，山楂總黃酮的研究開(kāi)發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，山楂在獸藥飼料中的開(kāi)發(fā)與利用應(yīng)備受關(guān)注。

在我國(guó)該屬植物種類繁多且分布廣泛，《甘肅中草藥資源志》[8]中記載的原植物有山楂、山里紅、甘肅山楂、華中山楂四種。試驗(yàn)對(duì)甘肅山楂與山里紅果實(shí)和葉片中總黃酮的提取及含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，以期為甘肅省該屬植物的綜合開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 METTLER AE240電子天平，METTLER AE110電子天平，BX8200HP超聲波清洗器，Evolution 300 LC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，粉碎機(jī)。

1.2 試劑與藥材 氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，乙醇，均為分析純，純化水。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，100080-200707)，山里紅果和葉藥材(購(gòu)于蘭州黃河藥市)，甘肅山楂果和葉(采于榆中官灘溝)，以上兩種材料均由蘭州大學(xué)馬志剛教授鑒定，以山里紅為例進(jìn)行方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 樣品與對(duì)照品溶液的制備 精密稱取山里紅果實(shí)粉末1.0 g，以20倍量60%乙醇回流1 h，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即為樣品溶液。

精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解，超聲助溶，放冷，定容至刻度，搖勻，即為對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.1.2.1 測(cè)定最大吸收波長(zhǎng) 將處理好的樣品溶液過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液1 mL至25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)行顯色處理。放置15 min后，以乙醇為空白，在480～570 nm處進(jìn)行掃描。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液亦按以上步驟進(jìn)行顯色、掃描。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液吸收曲線形狀相同，且均在507 nm處有最大吸收，故實(shí)驗(yàn)選取507 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

(1)蘆丁吸光光譜曲線; (2)山里紅吸收光譜曲線(1) Absorption spectrum curve of rutin (2) Absorption spectrum curve of Crataegus pinnatifida圖1 吸收光譜圖Fig 1 Absorption spectrogram

2.1.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取上述蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，按2.1.2.1所述方法，進(jìn)行顯色，靜置15 min后，以乙醇為空白，在507 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=12.607x-0.0055，R2=0.9996，在質(zhì)量濃度為0.0082～0.0820 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 2 Standard curve diagram

2.1.3 總黃酮工藝優(yōu)化

2.1.3.1 總黃酮含量測(cè)定 精密稱取1.0 g山里紅果實(shí)粉末，置于圓底燒瓶中，用一定量的乙醇回流提取一段時(shí)間后，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；用乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，作為待測(cè)液；取0.5 mL待測(cè)液按2.1.2.1所述方法，進(jìn)行顯色，靜置15 min后，以乙醇為空白，在507 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。測(cè)3次，取平均值。根據(jù)回歸方程，用吸光度計(jì)算出被測(cè)液中黃酮含量。

式中：V為提取液定容體積/mL；B為吸取測(cè)定體積/mL；C為線性方程計(jì)算出的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；D為測(cè)定時(shí)定容體積/mL；m為稱取的樣品質(zhì)量/g。

2.1.3.2 單因素試驗(yàn)

2.1.3.2.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取量的影響 精密稱取5份山里紅果實(shí)粉末樣品各1.0 g置于100 mL圓底燒瓶中，分別加入30 mL乙醇溶液作為溶劑，控制乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，提取2 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用乙醇定容至50 mL。從中取1 mL按4.2.1.2.1所述方法顯色，在波長(zhǎng)507 nm處測(cè)定提取液吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度影響Fig 3 Effect of ethanol concentration

由圖可知，隨著乙醇濃度的增大，山里紅果實(shí)粉末總黃酮的提取率先增大后減小，這可能是因?yàn)橐掖紳舛鹊脑黾訒?huì)使一些醇溶性雜質(zhì)的溶出量增加，這些雜質(zhì)與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)乙醇，從而導(dǎo)致溶出的黃酮類化合物減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，60%乙醇作為提取濃度時(shí)總黃酮提取率最高。因此，選定60%、70%、80%作為正交實(shí)驗(yàn)中乙醇濃度的三個(gè)水平。

2.1.3.2.2 料液比 精密稱取5份粉碎的山里紅果實(shí)粉末樣品各1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，分別用60%乙醇溶液作為溶劑，控制料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取2 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用60%乙醇定容至50 mL。從中取1 mL按2.1.2.1所述方法顯色，在波長(zhǎng)507 nm處測(cè)定提取液吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比的影響Fig 4 Effect of Solid-liquid ratio

由圖可知，隨著料液比的減小，山里紅果實(shí)總黃酮的提取率增大，但料液比達(dá)到1∶40后，提取率趨于穩(wěn)定，此時(shí)黃酮類化合物已基本提取完全。且考慮到乙醇濃度過(guò)高會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此，選定1∶20、1∶30、1∶40作為正交實(shí)驗(yàn)中料液比的三個(gè)水平。

2.1.3.2.3 提取時(shí)間 精密稱取5份山里紅果實(shí)粉末樣品各1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，分別加入30 mL60%乙醇溶液作為溶劑，控制提取時(shí)間為1、2、3、4 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用60%乙醇定容至50 mL。從中取1 mL按2.1.2.1所述方法顯色，在波長(zhǎng)507 nm處測(cè)定提取液吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間的影響Fig 5 Effect of extracting time

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),提取得到的總黃酮逐漸增加，3 h后提取率增加緩慢。為了提高提取效率和縮短生產(chǎn)周期。選定1、2、3 h作為正交實(shí)驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)的三個(gè)水平。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取時(shí)間(1、2、3、4 h)等影響因素進(jìn)行分析，擬定影響山里紅果實(shí)總黃酮提取率的四個(gè)因素即A(乙醇濃度)、B(料液比)、 C(提取時(shí)間)、D(提取次數(shù))為優(yōu)選因素，每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以確定山里紅果實(shí)總黃酮的最佳提取條件。

2.1.3.3 正交優(yōu)化試驗(yàn) 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of orthogonal test

表2 山里紅果實(shí)總黃酮提取正交試驗(yàn)因素水平表Tab 2 Orthogonal factor level table for total flavonoidsextraction of C.kansuensis fruit

表3 山里紅和甘肅山楂的果實(shí)和葉片中總黃酮的含量(n=3)Tab 3 The content of Flavonoids in fruit or leaf ofC.kansuensis and Crataegus pinnatifida(n=3)

由表2中的R極差分析可以得出，各因素影響的主次關(guān)系為D>A>C>B。山里紅總黃酮的最佳提取條件為A1B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40、提取時(shí)間3 h、提取次數(shù)3次。按A1B3C3D3組合平行進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到山里紅和甘肅山楂的果實(shí)和葉片中的總黃酮提取率平均值，見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，山里紅果和甘肅山楂果中總黃酮的平均含量分別為7.91%和6.75%，葉中的平均含量分別為2.55%和3.35%。

2.1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.3.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取2 mL蘆丁對(duì)照品溶液(0.41 mg/mL)置于25 mL容量瓶中，顯色后，在507 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。計(jì)算RSD=0.01%，RSD<5%，表明精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of the precision experiment

2.1.3.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選出的方法制備山里紅果實(shí)粉末的供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法顯色，室溫下分別放置 0、2、4、8、24、48 h 后，在507 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度。計(jì)算得其RSD分別為1.68%，RSD<5%，說(shuō)明供試品在兩天內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of the stability Experiment

2.1.3.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取5份山里紅果實(shí)粉末，精密稱定，按優(yōu)選出的方法制備供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法顯色，507 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。計(jì)算含量，計(jì)算RSD=3.03%，RSD<5%，說(shuō)明優(yōu)選方案的重現(xiàn)性良好。計(jì)算濃度時(shí)使用之前的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=12.607x-0.0055，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 6 Results of the reproducibility Experiment

2.1.3.4.4 加樣回收試驗(yàn) 取9份2.1.3.4.3項(xiàng)中的樣品各0.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，平均分為三組，各組分別精密加入對(duì)應(yīng)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.41 mg/mL)，進(jìn)行加樣回收率測(cè)定。測(cè)定量是由測(cè)得的吸光度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到的含量。計(jì)算得，加樣回收率RSD=3.42%，回收率較高，偏差較小，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見(jiàn)表7。

加樣回收率=(測(cè)定量-已知量)/加入量×100%

已知量：取重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)所得的濃度1.5761 mg/mL來(lái)計(jì)算，即為V樣·C樣=0.7881 mg

3 討 論

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證各因素影響的主次關(guān)系為提取次數(shù)(D)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>提取時(shí)間(C)>料液比(B)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶40、提取時(shí)間為3 h、提取次數(shù)為3次是最佳提取條件。因此，最終確定甘肅山楂與山里紅總黃酮含量的測(cè)定方法為：精密稱取1.0000 g山里紅果實(shí)粉末，置于圓底燒瓶中，用60%乙醇為溶劑，按料液比為1∶40回流提取3 h，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液1 mL至25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)行顯色處理。放置15 min后，以乙醇為空白，在507 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。該方法的精密度、重現(xiàn)性良好，加樣回收率高，偏差較小，準(zhǔn)確度較高。

表7 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 7 Results of the recovery Experiment

山里紅和山楂在甘肅主要是人工栽培，且產(chǎn)量較山東、山西等大產(chǎn)區(qū)要少，而甘肅山楂在甘肅具有豐富的野生資源，卻鮮為利用[9]。

山楂屬植物全身是寶，山楂葉在《中國(guó)藥典》中有收錄，而在《中國(guó)獸藥典》中未有收錄，山楂葉在獸藥、飼料添加劑中的利用有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山楂總黃酮中3個(gè)主要有效成分分別為蘆丁、金絲桃苷、牡荊素。其中蘆丁為主要成分，因此作者只對(duì)蘆丁進(jìn)行了含量測(cè)定的研究，而其他兩種成分有待進(jìn)一步研究分析。

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