王光輝，唐亞楠，陳 楠，王虎霞，秦 倩，于田雨，盛 薇

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院普外科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院乳腺中心，陜西西安 710061；3. 陜西省腫瘤醫(yī)院乳腺中心，陜西西安 710061)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年增長的趨勢，目前已居女性群體惡性腫瘤發(fā)病率首位[1]。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)不僅用于局部晚期的乳腺癌患者，同樣廣泛適用于可手術的乳腺癌患者。NAC和術后輔助化療同樣有效，兩者在總生存率與無瘤生存率方面沒有明顯的統計學差異，更重要的是，NAC可以預測化療藥物在體內的敏感性，為后續(xù)治療提供依據。盡管NAC在乳腺癌的治療方面有許多優(yōu)勢，但并不是對所有的乳腺癌患者均有效，在如何選擇高效的化療藥物、制訂個體化方案以及預測治療效果等方面仍然不夠成熟，需要進一步的研究[1-2]。本研究通過分析NAC前后4種乳腺癌分子標志物(ER、PR、HER-2及Ki67)的表達改變，探討NAC對ER、PR、HER-2以及Ki67表達的影響，從而為乳腺癌患者制定精準個體化治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1材料收集西安交通大學第一附屬醫(yī)院2013年1月1日至2015年12月31日期間所收入的經芯針穿刺確診的初治女性乳腺癌患者165例。所有病例均行芯針穿刺活檢，且活檢前所有患者均未行包括放化療在內的特殊治療。活檢采用美國巴德公司的自動活檢槍以及16G的穿刺活檢針(MN324)，穿刺前行或不行超聲定位，每個腫瘤分3個方向取材2～6條圓柱狀標本。手術標本離體后，100 mL/L甲醛溶液固定24～72 h，石蠟包埋，并制作4 μm厚連續(xù)切片。依據是否于術前行NAC分為NAC組和對照組，其中納入NAC組患者62例，年齡28～73歲，中位年齡49歲；納入對照組患者103例，年齡27～86歲，中位年齡50歲。所有患者臨床分期參照NCCN指南2015版制定。

1.2免疫組化染色(SP法) 標本切片經二甲苯脫蠟，標準梯度乙醇至水化，高溫高壓進行抗原修復，H2O2室溫孵育20 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加相應一抗(稀釋比1∶1 000)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后滴加DACO二抗，DAB液顯色，蒸餾水沖洗，經明礬蘇木素復染，逐級脫水封固后采用光學顯微鏡進行觀察。本研究所用的ER、PR、HER-2、Ki67一抗，以及二抗和SP試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3NAC方案62例采用含蒽環(huán)類或紫杉類為基礎的化療方案，其中45例行TE或TA方案，21 d為1個化療周期；9例行TCH方案，21 d為1個化療周期；6例行TEC或TAC方案，21 d為1個化療周期。共治療2～6個周期不等。2例因治療過程中行FISH檢測明確HER-2過表達而更改化療方案；1例先行CEF化療2周期，后調整為TCH方案化療4周期；另外1例患者先行TE方案化療2周期，后調整為TCH化療4周期。

1.4NAC效果評估NAC組患者通過臨床觸診、乳腺超聲、鉬靶X線攝片以及乳腺磁共振隨訪腫物大小，同一患者均以同一種方法測量腫物大小以便對比，近期療效評價均要維持4周以上確認。以實體瘤反應評價標準1.0(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)為標準評估NAC的療效。分為完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)、疾病進展(progressive disease, PD)。CR+PR為總有效率RR(response rate)。NAC組62例患者中，有4例患者經過NAC達到病理完全緩解(PCR)，術后病理提示未見癌細胞浸潤，因此對其余58例患者進行ER、PR、HER-2、Ki67檢測。

1.5NAC組及對照組乳腺癌患者手術治療NAC組患者在新輔助化療結束后2～3周內接受手術治療，對照組患者均在芯針穿刺確診乳腺癌1周內接受手術治療。腋窩觸診陽性或穿刺確診存在淋巴結轉移者直接行腋窩淋巴結清掃。腋窩觸診陰性患者行前哨淋巴結活檢，明確腋窩情況，無轉移只行乳腺單切或保乳術，若前哨淋巴結存在轉移，則行腋窩淋巴結清掃。

1.6統計學分析實驗數據由SPSS 22.0統計分析軟件處理。計數資料比較使用χ2檢驗或Pearson相關性分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NAC組與對照組病理特點及分子亞型的對比NAC組與對照組ER、PR、HER-2、Ki67表達以及組織學分級情況見表1，分子亞型對比見圖1。

表1 NAC組與對照組病理學特點的對比Tab.1 Pathological characteristics in NAC group and control group [n(%)]

圖1 NAC組和對照組分子亞型分布Fig.1 Distribution of molecular subtypes in NAC group and control group

2.2NAC對ER、PR、HER-2、Ki67表達的影響與對照組相比，NAC組58例乳腺癌患者中，ER、PR表達的差異無統計學意義(P=0.378、P=0.227)；而HER-2、Ki67表達的差異有統計學意義(P=0.026、P=0.006，表2)。

表2 NAC組與對照組ER、PR、HER-2、Ki67表達情況Tab.2 Comparison of the changes of ER, PR, HER-2 and Ki67 expression status in NAC group and control group

2.3NAC后Ki67表達變化與化療療效的相關性NAC前后Ki67表達變化顯著，因此我們進一步探討Ki67的表達對NAC療效的預測價值。結果表明，NAC組中Ki67高表達患者與低表達患者在NAC療效方面的差異有統計學意義(P=0.038，表3)。因此，NAC前Ki67高表達狀態(tài)以及NAC后Ki67增生指數的下降往往預示著更好的化療效果。Pearson相關分析提示，NAC治療后Ki67表達狀態(tài)的下降與化療效果呈明顯的正相關(r=0.732，P=0.016，圖2)。

表3 Ki67表達狀態(tài)與NAC療效的相關性Tab.3 Relationship between Ki67 expression status and NAC efficacy

圖2 NAC治療后Ki67表達變化與化療效果的相關性Fig.2 Relationship between the change of Ki67 expression status after NAC and NAC efficacy

3 討 論

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展受多個基因調控，其中某些基因在乳腺癌的診療以及預后評價等方面具有重要意義。在乳腺癌相關的分子生物標記物中，ER、PR、HER-2以及Ki67是公認與乳腺癌關系最為密切的基因，其表達情況對患者治療方案的選擇以及預后評估至關重要。在本研究中，通過比較接受NAC患者的乳腺癌標本中ER、PR、HER-2及Ki67表達狀態(tài)的變化，我們發(fā)現NAC對ER和PR的表達影響較小，而對Ki67影響顯著。同時，NAC前Ki67的表達水平能夠作為預測化療療效的指標，對于制定乳腺癌臨床治療方案具有一定參考價值。

ER、PR的表達狀態(tài)不僅可以用來指導內分泌治療的選擇，而且是評估乳腺癌預后的重要指標。因此，關于NAC是否會改變ER、PR的表達狀態(tài)一直備受關注，而且在不同的研究中出現了不同的結果。蔣奕等[3]收集80例行NAC的乳腺癌化療前后病理標本，用免疫組化SP法檢測其ER、PR的表達情況，結果發(fā)現NAC前后ER、PR的表達狀態(tài)無明顯差異(P>0.05)。車瀟良等[4]發(fā)現53例乳腺癌患者中分別有9(18%)、11(22%)例出現NAC前后ER、PR的表達發(fā)生完全相反地改變，差異無統計學意義(P>0.05)，提示NAC不會影響乳腺癌患者ER、PR的表達。然而，也有部分學者發(fā)現NAC能夠影響ER和PR表達的改變。YANG等[5]報道，NAC能顯著改變乳腺癌患者ER和PR的狀態(tài)，與非化療組相比，該差異具有統計學意義(P均<0.05)。GAHLAUT等[6]發(fā)現NAC可以明顯增加ER的表達水平。FRASSOLDATI等[7]發(fā)現NAC可以明顯降低ER的表達水平。也有研究認為NAC可以使ER、PR的表達狀態(tài)呈現出由陰轉陽的趨勢，原因是NAC優(yōu)先消滅了ER和/或PR陰性的腫瘤細胞。本研究發(fā)現，NAC組的乳腺癌患者術前與術后標本ER、PR表達狀態(tài)的改變率分別為12.1%(7/58)、10.3%(6/58)，而對照組中ER、PR表達狀態(tài)改變率分別為7.8%(8/103)、10.7%(11/103)，兩組ER、PR表達狀態(tài)的改變率無明顯差異(P>0.05)?？紤]到本研究納入的樣本量較少，對于NAC是否影響ER和PR表達，還需要多中心大樣本研究進一步證實。

HER-2是判斷乳腺癌預后的重要指標，HER-2過表達的腫瘤惡性程度高、侵襲性強、預后差。HER-2的過表達已經成為公認預測以蒽環(huán)類為基礎的輔助化療療效的指標，以蒽環(huán)類為基礎的化療可以改善HER-2過表達乳腺癌患者的無瘤生存率和總生存率[8]。許多研究發(fā)現，NAC前后HER-2的表達狀態(tài)表現不一致。GENNARI等[9]發(fā)現NAC后HER-2表達水平有明顯的上升趨勢，而YOSHIDA等[10]的研究結果則與之相反；YANG等[5]的研究發(fā)現，NAC后患者HER-2表達狀態(tài)有明顯改變，但這種改變無明顯趨向性。本研究發(fā)現NAC組的乳腺癌患者術前與術后標本HER-2表達狀態(tài)的改變率為8.6%(5/58)，而未行NAC的對照組中術前和術后標本中HER-2表達狀態(tài)改變率為22.3%(23/103)，且該差異有統計學意義(P<0.05)。

Ki67是與細胞有絲分裂密切相關的核抗原，在細胞有絲分裂G0期以外的各期均可檢測到Ki67的表達。Ki67可以反映腫瘤的增殖活性，國內外學者發(fā)現，Ki67與乳腺發(fā)生、轉移等密切相關，而且Ki67高表達的患者預后欠佳[11]。關于NAC是否會影響Ki67的表達狀態(tài)仍然備受爭議。TANAKA等[12]的研究發(fā)現NAC可使Ki67表達陽性率降低，而且可以明顯降低Ki67的表達水平。但有些研究卻認為Ki67的表達狀態(tài)在NAC前后無顯著改變[13]。本研究發(fā)現，NAC組與對照組的乳腺癌患者術前與術后標本Ki67表達狀態(tài)的改變率分別為39.7%(23/58)、19.4%(20/103)，NAC組Ki67的改變率明顯高于對照組，且具有統計學差異(P<0.05)。上述結果支持NAC能夠影響乳腺癌組織中Ki67表達水平的觀點。目前，有許多研究對Ki67能否作為NAC療效預測指標進行探討。有研究認為相較于Ki67陰性的患者，Ki67陽性的乳腺癌患者對NAC更敏感[14-15]。而劉新杰等[16]卻認為Ki67的表達狀態(tài)與NAC療效無明顯相關性。我們認為Ki67的表達狀態(tài)可作為預測NAC療效的重要指標，本研究提示化療藥物可能是通過抑制Ki67的表達來抑制惡性腫瘤的生長。

綜上所述，ER、PR的表達情況與新輔助化療療效無明顯相關性。赫賽汀不能使HER-2過表達的乳腺癌患者行NAC時受益?；熐癒i67高表達狀態(tài)以及化療后Ki67增生指數的下降往往預示著更好的化療效果，由此可推斷NAC可能是通過抑制Ki67使腫瘤縮小，Ki67可成為預測NAC療效的獨立指標。本研究在一定程度上可以為今后的臨床研究提供一種新思路。

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