華瑩 李濤 陳眷華 林家棟 王開功 余四九

（1，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 730070；2，貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 550008；3，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 550025）

豬藍(lán)耳病病毒即豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是豬藍(lán)耳病的病原。豬藍(lán)耳病于1987年美國首次發(fā)現(xiàn)后，在不到10年時(shí)間，PRRS幾乎傳遍全世界養(yǎng)豬國家，其原因可能與PRRSV存在廣泛的傳播途徑有關(guān)。PRRSV除了可以直接接觸傳播外，可通過感染公豬的精液、污染的用具和車輛等進(jìn)行傳播，還可通過母體胎盤和乳汁傳遞給仔豬，特別是蚊、蠅、鼠等傳播PRRSV[1-3]。但這些研究結(jié)果均認(rèn)為，蚊、蠅、鼠等只能機(jī)械性攜帶PRRSV，不能作為PRRSV的生物性傳播媒介。

自2006年夏秋以后，我國南方大部分地區(qū)爆發(fā)了以PRRSV變異毒株引起的高致病性PRRS，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這些PRRSV變異毒株的主要變異特點(diǎn)是Nsp2基因90個(gè)核苷酸不連續(xù)缺失和GP5基因點(diǎn)突變。這些基因變異特別是Nsp2基因的90個(gè)核苷酸缺失，導(dǎo)致病毒從以侵害呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)為主擴(kuò)展到可侵染宿主各個(gè)組織器官，從而具有極高的發(fā)病率和死亡率。值得注意的是，2006年以來發(fā)生的高致病性PRRS疫情主要在夏秋溫暖季節(jié)[4-6]，這也是蚊蟲滋生活動(dòng)季節(jié)。從上述PRRSV組織嗜性改變和PRRS發(fā)生季節(jié)等特點(diǎn)，可以推測高致病性PRRSV有可能存在生物性媒介。因此，本研究以我國養(yǎng)豬場常見蚊種之一即白紋伊蚊為實(shí)驗(yàn)對象，研究觀察PRRSV在白紋伊蚊體內(nèi)增殖的可能性，以期為高致病性PRRSV生物傳播機(jī)制研究和PRRS預(yù)防控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 毒株和蚊種

實(shí)驗(yàn)毒株：PRRSV GY株 （106.5 TCID50），為PRRSV變異毒株，從貴陽市郊區(qū)某養(yǎng)豬場的發(fā)病豬只體內(nèi)組織器官分離鑒定并保存。

實(shí)驗(yàn)蚊種：白紋伊蚊蟲卵，購自四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室，購回后在實(shí)驗(yàn)室自行孵育和飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

AMV Rtase、 RNase inhibitor、 dNTP （2.5 mmol/L）、 LA Taq DNA聚合酶等，購自大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒，為德國QIAGEN公司產(chǎn)品；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清等，為澳大利亞PAA公司產(chǎn)品；其他試劑，均為分析純。

1.3 主要儀器

Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡和Leica UC6型超薄切片機(jī)，為FEI公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，德國Eppendorf公司；凝膠成像儀，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；NanoDrop分光光度計(jì)，美國Thermo公司；Galaxy CO2恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 白紋伊蚊飼養(yǎng)

取蚊卵濾紙，放入濕潤紗布，置于溫度26～28℃和相對濕度80～90%的蚊蟲飼養(yǎng)房，光照14h/d，孵育24h，放入自然脫氯48h自來水中，孵育成幼蟲 （孑孓）后，加調(diào)制呈稀糊狀的豬肝粉飼喂，直至孵化成蛹；吸取蛹蟲，放入盛有自然脫氯48h自來水的燒杯中，置于50cm×50cm×50cm蚊籠；待其羽化成蚊后，放入含5%葡萄糖水的紗布讓其吸食；羽化后3～5d時(shí)，加入新鮮豬血讓其吸食，放入盛有濾紙和水的燒杯供其產(chǎn)卵。

2.2 蚊吸病毒液制備

取新鮮培養(yǎng)的PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3～5次，4℃ 12000rpm離心10min，取上清液與新鮮豬血按1∶1比例混勻，即為蚊吸病毒液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 白紋伊蚊吸染PRRSV

取羽化3～5d成蚊，停飲葡萄糖水24h，取浸透病毒液的脫脂棉塊2塊，置于蚊籠底部和頂部，供其吸食1h后放入冰箱凍麻，挑取飽血成蚊移入蚊籠，按常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，收集不同飼養(yǎng)時(shí)間成蚊，放入冰箱凍死備用。

2.4 病毒總RNA提取

取吸染PRRSV后不同時(shí)間段的成蚊及其世代樣本，生理鹽水漂洗后置于預(yù)冷研缽，快速研磨并收集至離心管，加入適量RNAisoTM Plus試劑及其1/5體積氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，4℃12 000r/min離心15min，取上清移至新離心管，加等體積異丙醇，室溫靜置10min，4℃12 000r/min離心10min，棄上清液，加75%乙醇1ml清洗沉淀，4℃12 000r/min離心5min，棄上清，干燥后用40μl DEPC水溶解，即為蚊蟲病毒總RNA樣本。

2.5 病毒RT-PCR檢測

取蚊蟲RNA樣本，采用PRRSV N基因引物 （5/-TCATCGCCCAACAAA ACCAG-3//5/-GCGTCGGCAAACTAAACTCC-3/，預(yù)期擴(kuò)增長度為240bp）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：42℃水浴反轉(zhuǎn)錄1h，94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s、55℃退火30s和72℃延伸40s，34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取8μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2.6 病毒粒子電鏡觀察

由四川大學(xué)分析測試中心電鏡室完成，即取成蚊樣本，3%戊二醛浸泡固定過夜，PBS清洗，4℃1%鋨酸固定2h，PBS清洗，放入30%、50%和70%丙酮醋酸鈾，4℃脫水10min，放入80%、90%和100%丙酮中，室溫脫水10min；在1∶1純丙酮/包埋液混液和包埋液浸透2h，包埋后行超薄切片，醋酸雙氧鈾液染色20min，電子顯微鏡觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 吸染后白紋伊蚊成蟲體內(nèi)病毒RT-PCR檢測結(jié)果

取不同時(shí)間段白紋伊蚊的總RNA提取樣本，采用PRRSV N基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

圖1 白紋伊蚊體內(nèi)PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果M：200bp DNA Markers；1：陽性對照；2-12：0h～7d蚊蟲樣本；13：陰性對照

從圖1可看出，吸染PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊樣本中可檢測出PRRSV N基因特異性片段 （240bp），而吸染PRRSV后30h、36h、42h、48h、120h和168h成蚊樣本中均未能檢出，說明PRRSV在白蚊伊蚊體內(nèi)只能存在24h左右，不能長時(shí)間存留。

3.2 吸染后白紋伊蚊世代體內(nèi)病毒RT-PCR檢測結(jié)果

取吸染 PRRSV后成蚊所產(chǎn)蚊卵孵育 24h、48h、96h、168h幼蟲和蛹及其24h、72h成蚊的RNA樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2所示，在各個(gè)世代蚊樣本中均未檢測出PRRSV N基因特異性片段，提示PRRSV不能在蚊中進(jìn)行世代傳遞。

3.2 白紋伊蚊成蟲體內(nèi)病毒電子顯微鏡觀察結(jié)果

取吸染PRRSV后12h、24h、48h和120h的白紋伊蚊樣品，常規(guī)方法固定，送至四川大學(xué)分析測試中心電鏡室進(jìn)行超薄切片，電鏡觀察，結(jié)果見圖3所示，吸染PRRSV后12h、24h、48h和5d的蚊樣本中均未觀察到PRRSV病毒粒子，提示白紋伊蚊可能只是機(jī)械性攜帶PRRSV。

4 討論

我國國土地域遼闊，地理景觀復(fù)雜多樣，媒介昆蟲種類繁多，僅蚊蟲種類就達(dá)600多種。貴州為云貴高原山地，平均海拔500m左右，氣候溫和，雨水充沛，年平均氣溫16℃左右，為蚊蟲生存提供了適宜的自然條件。研究資料顯示，我國南方地區(qū)養(yǎng)豬場孳生的主要優(yōu)勢蚊種是三帶喙庫蚊（Culex tritaenior-hynchus）、 白紋伊蚊 （Aedes albopictus）和致卷伊蚊 （Culex quinquefasciatus）等，其中白紋伊蚊 （Aedes albopictus）是貴州省大部分養(yǎng)豬場的主要優(yōu)勢蚊種之一。白紋伊蚊雖在南方養(yǎng)豬場中的數(shù)量沒有三帶喙庫蚊數(shù)量多，但其分布比三帶喙庫蚊廣泛，從我國南方向北至沈陽市，西北至隴縣、寶雞市，西南至西藏自治區(qū)都有白紋伊蚊的存在，而且外界野生的白紋伊蚊種群數(shù)量大，活動(dòng)季節(jié)長，吸血性強(qiáng)，嗜吸人血，兼吸哺乳動(dòng)物血[7,8]。資料顯示，白紋伊蚊可以攜帶日本乙型腦炎病毒 （Japanese encephalitis virus,JEV）、夏季腦炎病毒 （Spring-summer encephalitis virus,SSEV）、新疆出血熱病毒 （Xinjiang haemorrhagic fever virus,XHFV）和登革熱病毒 （Dengue fever virus,DENV）等。目前，從事病原生態(tài)學(xué)或寄生蟲學(xué)研究的科研院所實(shí)驗(yàn)室所馴化的蚊種主要是白紋伊蚊，且主要馴以吸實(shí)驗(yàn)白鼠、仔豬等動(dòng)物血為主。因此，本研究選擇白紋伊蚊作為實(shí)驗(yàn)對象。

圖2 各世代蚊體內(nèi)PRRSV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果M：100bp DNA Markers，1：陽性對照，2：蚊卵，3-6：1d/2d/4d/7d幼蟲；7：蛹，8-9：1d/3d成蚊，10：陰性對照

PRRSV為套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒成員，其基因組為單股正鏈RNA，包含9個(gè)開放閱讀框，其中ORF7基因即N基因在PRRSV基因組中高度保守，所編碼的N蛋白在病毒粒子中含量也高達(dá)40%[9,10]。可見，N基因是PRRSV基因組中最保守也是表達(dá)量最高的基因，在PRRSV實(shí)驗(yàn)室檢測上得到廣泛的應(yīng)用。因此，本研究選擇N基因作為蚊蟲樣本中PRRSV檢測的首選基因。

病毒的生物性媒介需要具備兩個(gè)基本條件[11,12]：一是病毒能在其體內(nèi)進(jìn)行增殖并達(dá)到有效的致病濃度；二是增殖的病毒粒子能在其體內(nèi)存留5～14d以上。研究資料顯示，日本乙型腦炎病毒、登革熱病毒等均可在白蚊伊蚊體內(nèi)進(jìn)行增殖，具備上述條件，可作為這些病毒的生物性傳播媒介。但白蚊伊蚊是否能作為高致病性PRRSV的生物性傳播媒介，需要實(shí)驗(yàn)證明。本實(shí)驗(yàn)通過吸染高致病性PRRSV后，采集不同時(shí)間段白紋伊蚊成蚊進(jìn)行PRRSV N基因檢測和蚊蟲體內(nèi)病毒粒子觀察，結(jié)果顯示吸染 PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊樣本中檢測到PRRSV核酸，時(shí)間不超過2d，且電子顯微鏡觀察各個(gè)階段白蚊伊蚊體內(nèi)均未見到PRRSV病毒粒子。這些結(jié)果提示，PRRSV不能在白蚊伊蚊體內(nèi)進(jìn)行增殖，也就是說白蚊伊蚊不是PRRSV的生物性傳播媒介，只是吸食含PRRSV感染豬血后可機(jī)械性攜帶而已。

圖3 不同吸染時(shí)間蚊樣本電鏡觀察結(jié)果1.吸染12h蚊樣本；2.吸染24h蚊樣本；3.吸染48h蚊樣本；4.吸染120h蚊樣本

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