李喬喬，張麗君，黃志立，王飛，吳振強，王妍

1 華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006

2 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055

關(guān)節(jié)軟骨是高度分化的組織，它的組織結(jié)構(gòu)決定了軟骨細(xì)胞代謝緩慢，受損傷后難以自行修復(fù)，如果關(guān)節(jié)軟骨損傷未得到及時修復(fù)，則會造成骨性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)軟骨損傷及缺損一直是骨科治療的難題[1-2]。目前，組織工程軟骨已在臨床應(yīng)用方面進(jìn)行了初步嘗試，為臨床軟骨缺損的修復(fù)提供了新的思路與途徑，種子細(xì)胞、生物材料以及細(xì)胞因子是組織工程軟骨的重要因素。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs) 具有自我增殖能力和多向分化潛能，在特定條件下可分化為軟骨細(xì)胞，且移植后能夠與軟骨下板更好地融合，是軟骨組織工程的理想細(xì)胞，已有的研究表明細(xì)胞因子是定向誘導(dǎo)hMSCs分化成軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵因素，如轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)、地塞米松(DEX) 等[3-5]。然而細(xì)胞因子的作用是一個復(fù)雜的過程，其誘導(dǎo)效應(yīng)與細(xì)胞因子的來源、濃度、劑量等多種因素有關(guān)，需要不斷探索新的細(xì)胞因子以及各種因子相互作用關(guān)系，因此細(xì)胞因子對hMSCs誘導(dǎo)分化方向影響及作用機(jī)制一直以來都是干細(xì)胞研究中的一個熱點。

干擾素 β (IFN-β) 是成纖維細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，具有抗病毒、抗細(xì)胞分裂及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。重組人干擾素β (rhIFN-β) 是通過基因工程改造得到的，對性疣、多發(fā)性硬化癥、丙型肝炎及相關(guān)肝癌、其他病毒性疾病以及多種腫瘤具有明顯的療效，雖有研究表明其他亞型干擾素如干擾素γ對細(xì)胞增殖和分化有一定的作用，但重組人干擾素β體外對hMSCs向軟骨細(xì)胞分化作用的研究尚少[6-8]。本次實驗通過觀察重組人干擾素β1a對hMSCs向軟骨細(xì)胞分化的影響，探討重組人干擾素β1a體外是否能夠促進(jìn)hMSCs向軟骨細(xì)胞分化，為軟骨損傷治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

hMSCs細(xì)胞株 (賽業(yè) (廣州) 生物科技有限公司)，成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (賽業(yè)(廣州) 生物科技有限公司)，成軟骨分化培養(yǎng)基(賽業(yè) (廣州) 生物科技有限公司)，胰酶 (美國Gibco 公司)，Trizol (美國 Invitrogen 公司)，SYBR熒光定量試劑盒 (美國 Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega生物技術(shù)有限公司)，內(nèi)參GAPDH(上海康成生物)，兔抗人 CollagenⅡ抗體 (英國Abcam公司)，兔抗人Sox9抗體 (英國Abcam公司)，羊抗兔IgG-HRP二抗 (美國Southern biotech公司)，重組人干擾素 β1a (以色列 ProSpec-Tany公司)，Alcain blue 染色試劑盒 (上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，GAG總含量檢測試劑盒 (上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。

Hera Cell 240型細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國熱電公司)，Olympus CKX41型倒置相差顯微成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)，凈安泰 BHC-1000IIA2型生物安全柜 (江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)，Eppendorf 5810 R 型臺式離心機(jī) (德國 Eppendorf公司)，Spectramax M5e型多功能酶標(biāo)儀 (美國Molecular Devices公司)，Real-time PCR 儀 (美國 ABI公司)，核酸蛋白測定儀 (德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 hMSCs細(xì)胞培養(yǎng)方法

hMSCs細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、1%5 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青/鏈霉素的成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃下于5% (體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞鋪滿瓶底時，用0.25% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的胰蛋白酶消化傳代，于每3天換液，每7天傳代，至第6代用于實驗。

1.2.2 hMSCs成軟骨細(xì)胞分化方法

取第6代hMSCs胰酶消化計數(shù)，2 000 r/min離心5 min，用軟骨分化培養(yǎng)基按照5.0×105cells/mL的密度進(jìn)行重懸。室溫下2 000 r/min離心5 min，吸去上清，分別加入1 mL成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的完全培養(yǎng)基、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅰ (含 10 ng/mL TGF-β3)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅱ (含 100 ng/mL IFN-β1a)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅲ (含 10 ng/mL TGF-β3 和 50 ng/mL IFN-β1a)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅳ (含 10 ng/mL TGF-β3 和 100 ng/mL IFN-β1a)、成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅴ (含 10 ng/mL TGF-β3和200 ng/mL IFN-β1a) 和成軟骨分化培養(yǎng)基Ⅵ (含10 ng/mL TGF-β3 和 400 ng/mL IFN-β1a)，室溫下2 000 r/min離心5 min，擰松離心管蓋以便氣體交換，將其放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。自接種開始計算，每隔3 d換液，換液后輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。

1.2.3 GAG總含量測定

收集誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞，按試劑盒說明測定GAG含量，方法如下：加入300 μL萃取液，充分混勻，56 ℃孵育16 h，90 ℃孵育10 min。13 000 r/min離心10 min，移取上清，置于冰上備用；取25 μL上清加入400 μL染色液，室溫下孵育30 min，避免光照，期間每隔5 min渦旋振蕩15 s，13 000 r/min離心10 min，抽去上清，加入400 μL解離液，室溫下孵育5 min，避免光照。取200 μL樣品，在酶標(biāo)儀上以656 nm波長測定OD值，每組3個復(fù)孔。

1.2.4 Alcain blue染色

取誘導(dǎo)21 d的軟骨球經(jīng)石蠟包埋切片，脫蠟和脫水，阿利新藍(lán)染液染色30 min，自來水沖洗2 min，蒸餾水沖洗1次，顯微鏡下觀察阿利新藍(lán)染色效果。

1.2.5 熒光定量 PCR檢測成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)

取誘導(dǎo)分化后細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green qPCR SuperMix進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增，檢測 Collangen Ⅱ和Sox9的mRNA表達(dá)，引物序列見表1。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，在Real-time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min ；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 32 s，共40個循環(huán)。以18S rRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算基因表達(dá)的相對水平。

1.2.6 Western blotting檢測成軟骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)

取誘導(dǎo)分化后細(xì)胞，按RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液煮沸10 min使其變性。SDS-PAGE凝膠電泳，然后用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，TBST漂洗1次5 min；將 PVDF膜置于含5%脫脂奶粉溶液中室溫?fù)u床封閉1 h，TBST洗膜1次10 min；分別加入含Collagen Ⅱ (1∶1 000)、Sox9 (1∶1 000)、內(nèi)參 GAPDH (1∶10 000) 一抗工作液4 ℃過夜，TBST 漂洗4次，每次10 min；用含標(biāo)記辣根過氧化物酶的二抗(1∶20 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。將雜交膜置于一透明塑料板上，注意不要讓膜干燥。用移液器將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，并使反應(yīng)持續(xù)5 min。用試劑盒提供的濾紙吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒顯影。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSSl9.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差 (±s)”的形式表示，采用t檢驗，若P<0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 GAG總含量檢測結(jié)果

糖胺多糖 (GAG) 總含量是代表hMSCs成軟骨分化水平的重要生化指標(biāo)。通過檢測細(xì)胞的GAG總含量，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)單獨添加10 ng/mL TGF-β3 組和單獨添加 100 ng/mL IFN-β1a 組無顯著差異 (P>0.05)。而 TGF-β3 和 IFN-β1a 聯(lián)合誘導(dǎo)組均高于單獨添加組，其中聯(lián)合添加10 ng/mL TGF-β3 和 100 ng/mL IFN-β1a 組顯著高于其他組GAG含量 (P<0.05)。結(jié)果表明在常規(guī)TGF-β3誘導(dǎo)分化過程添加 100 ng/mL IFN-β1a能夠提高GAG含量，促進(jìn)hMSCs成軟骨分化程度。

圖1 誘導(dǎo)過程添加不同IFN-β1a濃度對細(xì)胞GAG含量的影響Fig. 1 Effect of different IFN-β1a concentration on GAG content during chondrogenic differentiation of hMSCs.*P<0.05; **P<0.01.

2.2 hMSCs軟骨分化形態(tài)檢測結(jié)果

成軟骨立體誘導(dǎo)1 d時可見到離心管底有嵴狀突起形成，在誘導(dǎo)3 d可見突起形成小球狀。輕輕振蕩離心管可見小球在培養(yǎng)液中漂浮，并不散開，隨后小球緩慢增大。21 d后取出小球，小球柔軟略有彈性及一定的粘性。測量軟骨球直徑見圖2，可見常規(guī)TGF-β3誘導(dǎo)分化過程添加100 ng/mL IFN-β1a形成的軟骨球明顯大于其他組單一成分組。

2.3 阿利新藍(lán)染色結(jié)果

聚集蛋白聚糖是軟骨細(xì)胞表面標(biāo)志物，該物質(zhì)經(jīng)阿利新藍(lán)染色會呈現(xiàn)藍(lán)色。hMSCs誘導(dǎo)21 d成軟骨球后，切片、染色，結(jié)果見圖 3。TGF-β3和 IFN-β1a單獨添加組之間無明顯的差異。而常規(guī)TGF-β3誘導(dǎo)分化過程添加100 ng/mL IFN-β1a藍(lán)色所占比例明顯提高。組織染色結(jié)果也表明添加IFN-β1a能促進(jìn)hMSCs成軟骨分化。

2.4 熒光定量 PCR檢測成軟骨分化標(biāo)志基因表達(dá)結(jié)果

添加不同誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)4、7、11、14、21 d后，qRT-PCR檢測Sox9和Collagen Ⅱ基因mRNA表達(dá)水平。對于 Sox9，在誘導(dǎo)分化不同時間點，與對照組相比，其他各組表達(dá)量均顯著高于對照組，且 IFN-β1a 組和 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a組均顯著高于 TGF-β3組，但當(dāng)誘導(dǎo)至21 d 時，只有 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組顯著高于 TGF-β3組 (P<0.01) (圖 4A)。結(jié)果同時表明，隨著誘導(dǎo)分化時間延長，各誘導(dǎo)組中Sox9 mRNA的表達(dá)量均有升高，其中TGF-β3組和 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組增加顯著，而IFN-β1a組在第7天有明顯升高，而后隨著誘導(dǎo)時間延長，其表達(dá)量上升趨勢不明顯。對于Collagen Ⅱ，其 mRNA 的表達(dá)規(guī)律與 Sox9相似，但在第 7天之后，IFN-β組和 TGF-β3組之間表達(dá)無極顯著差異，而 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a組相對表達(dá)量在不同誘導(dǎo)時間點均顯著高于其他組 (圖4B)。

圖2 軟骨球形態(tài)學(xué)觀察Fig. 2 Morphological observation of cartilage ball. (A) Blank control group. (B) TGF-β3 group. (C) IFN-β1a group.(D) TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a group.

圖3 阿利新藍(lán)染色結(jié)果Fig. 3 Alcian blue staining results. (A) Blank control group. (B) TGF-β3 group. (C) IFN-β1a group. (D) TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a group.

圖4 Sox9 (A) 和Collagen Ⅱ (B) 的qRT-PCR檢測結(jié)果Fig. 4 qRT-PCR result of gene Sox9 (A) and Collagen Ⅱ (B).

2.5 Western blotting檢測成軟骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

添加不同誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)4、7、11、14、21 d后，收取各組細(xì)胞，Western blotting檢測SOX9和COL Ⅱ蛋白表達(dá)水平。檢測結(jié)果及灰度(IOD) 分析結(jié)果表明 (圖 5)，在不同誘導(dǎo)分化時間點，TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組的 SOX9 和COL Ⅱ蛋白均顯著高于其他組 (P<0.01)，且隨著分化時間延長，上述兩種蛋白表達(dá)呈上升趨勢。而 IFN-β1a組和 TGF-β3 相比較，第 21 天 IFN-β1a組表達(dá)的SOX9和COL Ⅱ蛋白顯著高于TGF-β3組，但只有在第11天IFN-β1a組表達(dá)的SOX9蛋白顯著高于 TGF-β3組，其他時間點均無顯著差異。而且隨著分化時間延長，IFN-β1a組和TGF-β3中SOX9和COL Ⅱ蛋白表達(dá)總體也呈上升趨勢。

3 討論

由于創(chuàng)傷、感染、痛風(fēng)和退行性病變等各種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)長期疼痛和功能障礙，所致關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床十分常見，軟骨組織因缺乏血管和神經(jīng)營養(yǎng)而自我修復(fù)能力不足，軟骨的缺損經(jīng)常會導(dǎo)致以軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成及關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥為病變特點的骨性關(guān)節(jié)炎 (Osteoarthritis，OA) 的發(fā)生[9-10]。體外構(gòu)建組織工程化軟骨是治療軟骨缺損的重要途徑之一，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有增殖傳代能力強、細(xì)胞均一性好、能夠多向分化、不存在倫理問題和排斥反應(yīng)等特點[11-12]，已經(jīng)成為體外構(gòu)建組織化工程軟骨的細(xì)胞來源之一[13-14]。但體外誘導(dǎo) hMSCs向軟骨細(xì)胞的定向分化需要在一定的誘導(dǎo)條件。細(xì)胞因子是誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵因素，其中細(xì)胞因子TGF-β超家族主要包括 TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3[15]，廣泛參與包括細(xì)胞增殖、分化、黏附、血管形成、骨骼形成和胚胎發(fā)育在內(nèi)的重要生命活動[16-17]。其中 TGF-β3對細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積有重要作用，在組織損傷修復(fù)中具有拮抗纖維化的作用，是最經(jīng)典的成軟骨誘導(dǎo)因子，可以促進(jìn)未分化或分化早期的軟骨細(xì)胞增殖[18]，使間質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，還可增加Ⅱ型膠原及蛋白多糖的合成[19-20]。因此TGF-β3、地塞米松、維生素 C的聯(lián)合應(yīng)用是體外誘導(dǎo) hMSCs向軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)的最經(jīng)典方案。但細(xì)胞因子來源、濃度和因子之間的相互作用都對細(xì)胞增殖分化有影響，因此需要探索更多細(xì)胞因子。

圖5 SOX9和COL Ⅱ的Western blotting檢測結(jié)果Fig. 5 Western blotting result of SOX9 and COL Ⅱ in hMSCs. (A) The immune fluorescent protein electrophoresis figure at five time points. lane Ⅰ: blank control group; lane Ⅱ: TGF-β3 group; lane Ⅲ: IFN-β1a group; lane Ⅳ:TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a group. (B) IOD analysis of SOX9. (C) IOD analysis of COL Ⅱ.

干擾素 β (IFNβ) 是成纖維細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，具有抗病毒、抗細(xì)胞分裂及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。目前已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物干擾素有10多個家族，其中人干擾素有7個家族，包括Ⅰ型干擾素α、β、ε、τ、ω、κ，Ⅱ型干擾素 γ[21]，另外，還發(fā)現(xiàn)了干擾素樣蛋白(Interferon-like proteins)，也稱為Ⅲ型干擾素。重組人干擾素 β (rhIFN-β) 是通過基因工程改造的一種糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，根據(jù)表達(dá)IFN-β體系的不同，可將其分為CHO細(xì)胞表達(dá)的 rhIFN-β1a和在E. coli中表達(dá)的rhIFN-β1b。國外上市的 rhIFN-β1a 與 rhIFN-β1b比較，rhIFN-β1a活性高、療效好，副反應(yīng)更少。雖然干擾素一直用于臨床抗病毒治療，但近年的研究也表明干擾素對細(xì)胞增殖分化有影響。Irudayam等[6]研究結(jié)果顯示IFN-α激活STAT-JAK通路促進(jìn)多功能干細(xì)胞分化。Diao等[22]研究結(jié)果顯示Ⅰ型IFN在體外增加平滑肌細(xì)胞數(shù)。Matatall等[23]發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型干擾素可促進(jìn)造血干細(xì)胞細(xì)胞分裂，干擾素γ信號有助于造血干細(xì)胞髓樣分化。Hirsch等[24]研究結(jié)果表明在體外低濃度IFN-β能夠降低小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞 (NPCs) 的凋亡，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行直接保護(hù)作用，從而治療多發(fā)性硬化癥。而對于研究干擾素β體外對hMSCs誘導(dǎo)分化研究尚少。

糖胺多糖 (GAG) 總含量是代表 hMSCs成軟骨分化水平的重要生化指標(biāo)。為了確定在常規(guī)TGF-β3誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中添加不同濃度 IFN-β1a成軟骨細(xì)胞分化的影響，本研究中首先比較了添加50、100、200、400 ng/mL 的 IFN-β1a后各組細(xì)胞的 GAG含量的變化，結(jié)果表明在含有 10 ng/mL TGF-β3的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基礎(chǔ)上添加 100 ng/mL IFN-β1a組顯著高于其他組GAG含量 (P<0.05)，說明IFN-β1a與TGF-β3聯(lián)合使用能夠促進(jìn)hMSCs成軟骨分化 (圖1)。誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化有平面培養(yǎng)和成球培養(yǎng)，離心管成球培養(yǎng)使細(xì)胞間的黏附增殖有利于細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，為維護(hù)細(xì)胞的代謝活動提供了適宜的微環(huán)境，聚集成球培養(yǎng)的 GAG、Collagen Ⅱ和 Sox9表達(dá)量高于平面培養(yǎng)[25]，hMSCs在成球培養(yǎng)條件下可獲得更強的向軟骨分化的能力[26-27]，因此本次實驗采用了成球培養(yǎng)。采用不同組誘導(dǎo)培養(yǎng)基對hMSCs進(jìn)行成球成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，測量結(jié)果表明，與對照組相比，TGF-β3 常規(guī)培養(yǎng)基組、100 ng/mL IFN-β1a 組、TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組軟骨球尺寸均大于對照組，且 TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a組軟骨球尺寸最大 (圖 2)。進(jìn)一步采用阿利新藍(lán)染色軟骨球中聚集蛋白聚糖 (Aggreecan)，結(jié)果也表明TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組的染色之后，藍(lán)色所占比例增多，說明添加 IFN-β1a之后能促進(jìn)hMSCs成軟骨分化程度 (圖3)。

除檢測添加IFN-β1a對上述成軟骨細(xì)胞組織化學(xué)指標(biāo)的影響之外，本研究在mRNA水平和蛋白水平研究了成軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白的影響。其中 Sox9是一種高遷移率族蛋白轉(zhuǎn)錄因子，是間質(zhì)祖細(xì)胞成軟骨分化早期階段的標(biāo)志[28]，Sox9不但能結(jié)合并激活非軟骨組織細(xì)胞的軟骨基因增強子序列，使之呈軟骨細(xì)胞表型[29]，其還能與 Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用調(diào)控軟骨細(xì)胞分化[30-31]。而Collagen Ⅱ是軟骨細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)成分，維持細(xì)胞的基本骨架，也是軟骨細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，臨床研究中多用于衡量軟骨細(xì)胞的數(shù)量和成熟狀態(tài)[32]，因此上述兩者是成軟骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物。本研究中的結(jié)果表明，在相同的誘導(dǎo)時間下，TGF-β3+100 ng/mL IFN-β1a 組中Sox9和Collagen Ⅱ在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均顯著高于TGF-β3組和IFN-β1a組，且隨著誘導(dǎo)時間的延長呈上升趨勢。而 TGF-β3組和IFN-β1a組中上述兩種標(biāo)志因子在相同誘導(dǎo)時間下，并非都有顯著性差異。且隨著誘導(dǎo)分化時間延長總體也呈上升趨勢，但I(xiàn)FN-β1a組在第7、11天后達(dá)到一個峰值，分析可能 IFN-β1a在開始階段會強烈地刺激hMSCs的成軟骨分化，隨著時間的推移這種刺激作用會減弱。上述研究結(jié)果表明，在常規(guī)的 TGF-β3誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中添加重組人IFN-β1a能促進(jìn)hMSCs成軟骨細(xì)胞定向分化，且能上調(diào)Sox9轉(zhuǎn)錄因子。但是，其具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究探索，以期為今后重組人IFNβ在細(xì)胞分化方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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