褚亞東，劉穎慧，陸洪斌，曹旭鵬，薛 松

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物工程組，大連116023）

1 引言

火星表面的大氣壓平均為600 Pa，是地球氣壓的0.5%；火星表面的溫度變化范圍為－143℃～35℃，火星大氣的主要成分是CO2，占火星大氣的96%；其次是N2，占1.89%；H2O 含量較低，僅占0.03%［1］?；鹦悄壳安皇且粋€(gè)生命宜居星球，但火星的資源開發(fā)利用和環(huán)境改造，可使火星形成類地球環(huán)境。目前，NASA科學(xué)家于2010年前后提出并被大家所接受的火星移居改造需要經(jīng)過“加熱、加氣、種樹、種地、生產(chǎn)、蓋房、搬家”七個(gè)階段和步驟。在種樹階段，人類可以將某些極端微生物和微藻、苔蘚帶到火星上繁衍［2］。

微藻是空間站中被廣泛深入研究的生物之一，其目的是作為生產(chǎn)者循環(huán)利用系統(tǒng)內(nèi)的氮、水、CO2等以制取有機(jī)物和氧氣，提供給空間站的人［3?5］。 公開報(bào)道中，歐美國家合作在國際空間站進(jìn)行了為期16個(gè)月的存活培養(yǎng)測試，最終獲得的兩株微藻，其中有一株為藍(lán)藻念珠藻，另一株為綠藻［6］。

發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme），在中國又名“發(fā)菜”，是一種陸生藍(lán)藻，生長在干旱、半干旱地區(qū)，具有極強(qiáng)的耐旱性、耐變溫、耐太陽輻射、耐鹽堿和耐貧瘠等生理學(xué)特性［7?9］。 此外，發(fā)菜對生存環(huán)境的選擇性很強(qiáng)，干?濕交替的微環(huán)境是其生長發(fā)育的必要條件［10］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜在低氣壓（100 Pa、600 Pa、1200 Pa）的長期冷熱頻繁交替條件下仍可以維持生命活動(dòng)，具有在類火星表面長期生存的可能性［11］。此外，發(fā)菜不僅可以改良荒漠化土壤［7］，且營養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)20% ～23%，碳水化合物為57%，粗脂肪為5.6% ～5.7%，其中人體必需的7種氨基酸占總量的35.83%，尤其亮氨酸、蘇氨酸、精氨酸和纈氨酸最為豐富，還可食用，有望成為改造類火星環(huán)境“先鋒植物”的首選［12?13］。 然而，目前并沒有從改造類火星環(huán)境等方面對微藻在類火星的生存條件和可控培養(yǎng)進(jìn)行研究和探索。

因此，本文擬通過在室內(nèi)搭建一套在線監(jiān)測模擬類火星環(huán)境密閉體系內(nèi)發(fā)菜復(fù)蘇時(shí)放氧速率的試驗(yàn)裝置，考察不同溫度下氣壓低于和高于相應(yīng)的水飽和蒸氣壓時(shí)對發(fā)菜光合放氧的影響，為微藻改造類火星環(huán)境的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 試驗(yàn)材料

發(fā)菜采自內(nèi)蒙古阿拉善盟，試驗(yàn)前已干燥存儲2年。

2.2 發(fā)菜復(fù)蘇監(jiān)測放氧裝置的搭建

本文擬考察發(fā)菜在類火星表面半開放體系復(fù)蘇的可行性，希望檢測出發(fā)菜在模擬火星氣壓組成，接近火星氣壓（600 Pa）條件下，發(fā)菜光合恢復(fù)的極限條件。因此，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)候我們首先考慮的是最低限度保障發(fā)菜能夠有活性，即發(fā)菜復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)定義為發(fā)菜放氧速率達(dá)到發(fā)菜在正常狀態(tài)的1%，即4μmol O2·h－1·g－1（DW） 。

為了模擬類火星環(huán)境低氣壓，我們設(shè)計(jì)了如圖1所示的試驗(yàn)裝置原理圖。本系統(tǒng)中使用絕對壓力傳感器替代普通真空壓力表，使壓力顯示更準(zhǔn)確，同時(shí)可以用于系統(tǒng)內(nèi)各管路部分體積的標(biāo)定，附以氣相色譜儀使氧氣濃度的計(jì)算更準(zhǔn)確。

圖1 發(fā)菜復(fù)蘇監(jiān)測放氧裝置原理圖Fig.1 Schematic diagram of the on?line O2 evolution monitoring system for N.flagelliforme recov?ery

通過選用高真空玻璃管，搭建成圖2所示的發(fā)菜復(fù)蘇監(jiān)測放氧裝置，通過調(diào)節(jié)閥門，在真空泵的抽氣作用下將發(fā)菜培養(yǎng)罐內(nèi)氣體置換為模擬氣，并可以將氣壓控制在接近火星的氣壓；真空泵可以通過調(diào)節(jié)閥門將取樣環(huán)氣體抽出使其接近真空，再調(diào)節(jié)三通閥，可將發(fā)菜培養(yǎng)罐內(nèi)氣體吸至取樣環(huán)內(nèi)，再調(diào)節(jié)閥門，由載氣帶入氣相色譜進(jìn)行檢測。

2.3 發(fā)菜復(fù)蘇培養(yǎng)條件

圖2 發(fā)菜復(fù)蘇監(jiān)測放氧裝置圖Fig.2 Set?up of the on?line O2 evolution monitoring system for N.flagelliforme recovery

發(fā)菜生長于干旱、半干旱地區(qū)，水分是其生長的主要限制因子。自然條件下，雨水、露水和霧氣是其生長所需水分的主要來源，環(huán)境水分條件是發(fā)菜生存生長的關(guān)鍵性因子［10］。干燥發(fā)菜能從相對濕度高于28.4%的環(huán)境空氣中吸取水分。而火星環(huán)境中氣壓為 600 Pa，氣態(tài)水也不足0.03%。因此，為了考察發(fā)菜復(fù)蘇時(shí)所需最低氣態(tài)水，我們在選擇氣壓的時(shí)候?qū)⒃诓煌瑴囟葪l件下氣壓和蒸氣壓對應(yīng)，目的是希望檢測發(fā)菜在接近火星低氣壓條件下，發(fā)菜復(fù)蘇的極限條件，而本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的難度在于很難穩(wěn)定控制體系內(nèi)的低氣壓。具體培養(yǎng)方法見下：

稱取1 g發(fā)菜，用去離子水清洗3至4次，放在液體BG11 培養(yǎng)基，25℃、40 μmol photons·m－2·s－1下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)好后，將發(fā)菜用濾紙吸干放在圖2裝置中的發(fā)菜培養(yǎng)罐中，溫度通過循環(huán)水浴分別設(shè)定為5℃、15℃、25℃。光照采用LED光源模擬火星光照環(huán)境（由于LED光源亮度易于控制光照從無到有再到不同光強(qiáng)的正弦波變化），光照階段光強(qiáng)以地球地表光強(qiáng)40%（即800 μmol photons·m－2·s－1）為上限呈正弦波變化，光暗比14 h∶10 h。將氣體置換為CO2和N2（體積比為95∶5），通過真空泵抽取真空達(dá)到測試壓力，壓力設(shè)定依據(jù)所對應(yīng)的水飽和蒸汽壓，如5℃的水飽和蒸汽壓為0.87 kPa，15℃的水飽和蒸汽壓為1.70 kPa，25℃的水飽和蒸汽壓為3.17 kPa。氣態(tài)水狀態(tài)時(shí)，氣壓低于相應(yīng)溫度的水飽和蒸氣壓，而液態(tài)水狀態(tài)時(shí)高于相應(yīng)的水飽和蒸氣壓，具體參數(shù)設(shè)定見表1。每個(gè)試驗(yàn)條件做了兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)。

此外，為了驗(yàn)證含水量是否是影響發(fā)菜在類火星環(huán)境中的重要影響因素，在5℃、氣壓為1.0 kPa以上為液態(tài)水狀態(tài)下，在發(fā)菜培養(yǎng)罐中分別加入5 mL和10 mL BG11液態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 不同溫度下水分狀態(tài)對發(fā)菜復(fù)蘇影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The experiment design of N.flagelliforme re?covery under different water and temperature conditions

2.4 光合放氧速率測定

具體低壓狀態(tài)下發(fā)菜放氧速率測定方法如下：首先設(shè)定循環(huán)水浴為試驗(yàn)溫度，然后打開真空泵，使除培養(yǎng)罐及載氣和氣相部分以外的系統(tǒng)處于真空狀態(tài)，再將預(yù)先復(fù)蘇的發(fā)菜放入培養(yǎng)罐中，封閉培養(yǎng)罐。將模擬氣源連接至入氣口處，使發(fā)菜培養(yǎng)罐與模擬氣源連通，然后再調(diào)節(jié)閥門使真空泵與培養(yǎng)罐連通，將培養(yǎng)罐氣氛置換為模擬氣。再次調(diào)節(jié)閥門，使培養(yǎng)罐與模擬氣源斷開，并控制培養(yǎng)罐達(dá)到所需氣壓，然后打開LED光源。對于放氧量的測定，以空氣為對照氣。在測定放氧時(shí)調(diào)節(jié)取樣三通閥，先將取樣環(huán)與真空管路連通，抽真空后再旋轉(zhuǎn)三通閥與培養(yǎng)系統(tǒng)連通，取樣。然后旋轉(zhuǎn)三通閥將取樣環(huán)隔離，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣四通閥，使進(jìn)樣環(huán)與載氣管路串聯(lián)，進(jìn)入氣相色譜。

在進(jìn)行放氧量測定的過程中，需要先測定氣相色譜峰面積與氧氣摩爾量的關(guān)系，如式（1）、（2）所示［14］：

式中，Va為標(biāo)準(zhǔn)空氣的進(jìn)樣體積，單位L；q為空氣中氧氣百分比，取20.947%；S為標(biāo)準(zhǔn)空氣氧氣峰面積，單位mV·s；Vmol為單位摩爾氣體體積，單位L；Mo為單位峰面積對應(yīng)的氧氣摩爾量，單位mol；Ta為環(huán)境溫度，單位℃。當(dāng)已知培養(yǎng)系統(tǒng)容積時(shí)，可測得系統(tǒng)內(nèi)總氧氣摩爾量，如式（3）所示：

式中，Ot為系統(tǒng)內(nèi)總氧氣摩爾量；As為樣品氣氧氣峰面積；Vt為系統(tǒng)總?cè)莘e；Vs為進(jìn)樣環(huán)體積。

通過氮?dú)馍V峰的增量與空氣中氮?dú)夥逖鯕夥宓姆迕娣e比值可以計(jì)算得出滲入系統(tǒng)內(nèi)的氧氣所占的峰面積，如式（4）所示：

式中，Sod為滲入系統(tǒng)的空氣引起的氧氣峰面積增量；Snd為滲入系統(tǒng)的空氣引起的氮?dú)夥迕娣e增量；So為參比空氣中氧氣峰面積；Sn為參比空氣中氮?dú)夥迕娣e。

結(jié)合式（3）、（4），系統(tǒng)內(nèi)發(fā)菜釋放的氧氣摩爾量計(jì)算如式（5）所示：

式中，Or為發(fā)菜釋放的氧氣摩爾量。

3 結(jié)果和討論

3.1 不同溫度和氣壓下水分狀態(tài)對發(fā)菜光合放氧影響

水分是發(fā)菜生理活性的重要限制因子，適宜的水分有助于發(fā)菜維持正常的生理代謝和生長［15?16］。 依據(jù)表1的溫度和氣壓設(shè)定，分別考察5℃、15℃、和25℃低于和高于相應(yīng)溫度的水飽和蒸氣壓時(shí)對發(fā)菜光合放氧的影響。

3.1.1 25℃不同氣壓下發(fā)菜光合放氧

圖3顯示的是25℃下氣態(tài)水和液態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響。從圖3B中可以看到在反應(yīng)器溫度為 25℃，氣壓為3.9～4.2 kPa變化范圍內(nèi)，為液態(tài)水狀態(tài)時(shí)，發(fā)菜放氧速率最高時(shí)為10 μmol O2·h－1·g－1（DW），是發(fā)菜在正常放氧速率（400 μmol O2·h－1·g－1（DW））的 3%。 但發(fā)菜放氧速率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降再上升的趨勢，這與畢永紅等（2003年）報(bào)道一致［16?17］。

為了考察氣態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響，將氣壓調(diào)至2.5 kPa（圖3 A）。在最初反應(yīng)3 h內(nèi)，氣壓低于3.5 kPa，體系內(nèi)為氣態(tài)水，放氧速率最高為 7 μmol O2·h－1·g－1（DW）。 由于體系存在水分，水分氣化，很難維持在2.5 kPa，在反應(yīng)大約3 h 氣壓上升，維持在3.5 ～4.3 kPa，放氧速率呈現(xiàn)下降的趨勢，但是在反應(yīng)25 h有所上升，此時(shí)放氧速率為2.5 μmol O2·h－1·g－1（DW）。通過比較可以得出，在25℃、液態(tài)水狀態(tài)下，發(fā)菜光合放氧能力比在氣態(tài)水狀態(tài)下更高，這驗(yàn)證了我們所推測的，在火星環(huán)境中，發(fā)菜生存的關(guān)鍵因素是水分。

圖3 25℃不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.3 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 25℃

3.1.2 15℃不同氣壓下發(fā)菜光合放氧

圖4顯示的是15℃下不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響。在15℃，氣壓為3.0～4.9 kPa（圖4B），此時(shí)水的狀態(tài)為液態(tài)水，發(fā)菜放氧速率最高時(shí)為 7 μmol O2·h－1·g－1（DW），比 25℃條件減少了約30%。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，與25℃液態(tài)水條件類似，放氧速率呈現(xiàn)出先下降后上升再下降趨勢。當(dāng)將氣壓調(diào)至1.5 kPa，但是由于體系內(nèi)在原因?qū)е碌膲毫ψ兓?，氣壓?.8 kPa左右，反應(yīng) 1 h，放氧速率為 4.7 μmol O2·h－1·g－1（DW），隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)4 h后發(fā)菜幾乎是完全干燥狀態(tài)，沒有水分，此時(shí)檢測不到放氧速率。這可能是由于發(fā)菜水分完全喪失時(shí)，光合作用的終止導(dǎo)致［12］。但是，反應(yīng)26 h后，放氧速率有所上升，為2.9 μmol O2·h－1·g－1（DW），但是，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因并不是很清楚。通過比較可以得出，在15℃、液態(tài)水狀態(tài)下，發(fā)菜光合放氧能力比在氣態(tài)水狀態(tài)下更高。

3.1.3 5℃不同氣壓下發(fā)菜光合放氧

圖4 15℃不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.4 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 15℃

當(dāng)反應(yīng)器溫度為 5℃，氣壓維持在 1.4～1.6 kPa，為液態(tài)水狀態(tài)時(shí)，發(fā)菜放氧的最大速率為5 μmol O2·h－1·g－1（DW）（圖 5 B），與 25℃ 和15℃液態(tài)水條件類似，放氧速率呈現(xiàn)出先下降后上升再下降趨勢。當(dāng)氣壓調(diào)至0.9～1.0 kPa，為氣態(tài)水狀態(tài)時(shí)（圖5 A），發(fā)菜的最高放氧速率為3 μmol O2·h－1·g－1（DW），反應(yīng) 1 h，放氧速率為3 μmol O2·h－1·g－1（DW），反應(yīng) 3 h 后，反應(yīng)器內(nèi)無液態(tài)水時(shí)，檢測不到放氧。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長放氧能力有所恢復(fù)，但是29 h后發(fā)菜又失去放氧能力。從以上數(shù)據(jù)推測，如果繼續(xù)將溫度降低到0℃時(shí)，發(fā)菜將不會有放氧，因此，本試驗(yàn)沒有設(shè)計(jì)做0℃以下的試驗(yàn)。

將5℃、15℃和25℃不同氣壓條件下發(fā)菜光合放氧最大放氧速率和平均放氧速率總結(jié)至表2中。從表2數(shù)據(jù)中可以看出，當(dāng)發(fā)菜在氣壓低于相應(yīng)溫度蒸氣壓下即沒有液態(tài)水的情況下，放氧能力下降，必需有少量液態(tài)水，且隨著溫度下降，放氧速率也會下降。本試驗(yàn)中，發(fā)菜復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)定義為發(fā)菜光合放氧速率達(dá)到發(fā)菜在正常狀態(tài)的 1% ，即 4 μmol O2·h－1·g－1（DW）。 因此，本試驗(yàn)中發(fā)菜復(fù)蘇的極限條件是5℃、1.4 kPa。

圖5 5℃不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.5 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

表2 不同溫度和氣壓下水分狀態(tài)對發(fā)菜光合放氧影響Table 2 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at dif?ferent temperatures

3.2 不同含水量對發(fā)菜光合放氧影響

李運(yùn)廣等報(bào)道發(fā)菜生長于干旱、半干旱地區(qū)，水分是其生長的主要限制因子［15］。為了確定在模擬火星條件下含水量對發(fā)菜光合放氧能力的影響關(guān)系，我們在最低溫度5℃條件下加入不同體積的BG11液體培養(yǎng)基（圖6）。在5℃、氣壓為1.7 ～1.9 kPa（水的狀態(tài)為液態(tài)水），加入 5 mL?BG11液體培養(yǎng)基，可以看到放氧速率最高值上升至7 μmol O2·h－1·g－1（DW）（圖 6A）；而當(dāng)加入10 mL BG11液態(tài)培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)菜的最大放氧速率上調(diào)至 12 μmol O2·h－1·g－1（DW），甚至超過了25℃液態(tài)水條件下最高速率 10 μmol O2·h－1·g－1（DW）（圖6B、表2）；此外，發(fā)菜復(fù)蘇過程中加入水分，整個(gè)復(fù)蘇過程（31 h），發(fā)菜保持著放氧能力。這個(gè)結(jié)果說明在類火星環(huán)境下水對發(fā)菜復(fù)蘇的影響很大。

圖6 5℃不同含水量對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.6 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

3.3 類火星環(huán)境下氣壓、水、溫度對發(fā)菜光合放氧復(fù)蘇影響力比較

發(fā)菜在野外生長地年最高氣溫可達(dá)39.1℃，最低低溫可達(dá)－28.0℃，變幅為67.1℃。在這種氣溫幅度中，地表最高氣溫可達(dá)65.7℃，地表最低溫度達(dá)－29.1℃，實(shí)際上發(fā)菜所能忍受的溫度差值達(dá)到94.8℃［9］。 因此溫度不是發(fā)菜生長的限制因素。此外，本試驗(yàn)室前期結(jié)果顯示在－20℃下，100 Pa、600 Pa、1200 Pa處理60 天后，發(fā)菜能夠在BG11培養(yǎng)基中恢復(fù)放氧［11］，這些結(jié)果已經(jīng)說明低溫和低氣壓不是限制發(fā)菜復(fù)蘇的因素。地球上的生物進(jìn)化到可以耐受高氣壓環(huán)境如深海環(huán)境，但是由于地球環(huán)境因素沒有類似于火星環(huán)境中的低氣壓，目前幾乎沒有關(guān)于生物對于低氣壓環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的研究［18］。

綜合5℃條件下水的不同狀態(tài)及含有液態(tài)水下發(fā)菜的放氧速率（表3），可以看到液態(tài)水是影響發(fā)菜復(fù)蘇的重要決定性因素，溫度和氣壓不是最大限制性因素。

表3 5℃下不同含水量對發(fā)菜光合放氧影響Table 3 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

4 結(jié)論

1）通過選用高真空玻璃閥門組件，使發(fā)菜在長時(shí)間存放后仍保持氣壓及氣體組成為所需狀態(tài)，成功搭建了在線監(jiān)測發(fā)菜復(fù)蘇放氧裝置。

2）檢測顯示5℃、15℃和25℃在高于和低于相應(yīng)水飽和蒸氣壓條件下，發(fā)菜光合放氧最大放氧速率分別為5、7 和10 μmol O2·h－1·g－1（DW），和1、2 和3 μmol O2·h－1·g－1（DW），驗(yàn)證了試驗(yàn)最初的設(shè)想，發(fā)菜在類火星條件下可以復(fù)蘇；而在5℃，低于水飽和蒸氣壓時(shí)，加入10 mL BG11時(shí)，發(fā)菜放氧速率最高上調(diào)至 12 μmol O2·h－1·g－1（DW），這說明水對發(fā)菜在類火星表面半開放體系復(fù)蘇的影響大于氣壓。

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