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(1.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 奉賢201403； 2.上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 奉賢201400)

0 引言

近年來，隨著社會(huì)發(fā)展和物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們對名特優(yōu)新產(chǎn)品的需求也不斷增長，而山雞因其外貌絢麗多彩、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、野味濃郁醇厚、營養(yǎng)豐富齊全而成為了人們的首選，市場需求與日俱增，人工養(yǎng)殖的規(guī)模和數(shù)量逐年上升。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國內(nèi)存欄商品種山雞約200萬套，年上市商品肉山雞近億羽、商品山雞蛋約5億枚，成為了特種養(yǎng)殖中規(guī)模最大的品種。自然環(huán)境下，野外生活山雞的抗病能力較強(qiáng)，幾乎無疾病發(fā)生。但近年來高密度的人工飼養(yǎng)，在加速山雞抗病能力退化的同時(shí)，也顯著增加了各類疾病的發(fā)生概率，特別是H9N2亞型禽流感等疫病，已嚴(yán)重危害了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前國內(nèi)養(yǎng)殖戶基本都是參照家禽的推薦程序進(jìn)行免疫，沒有專門適用于山雞的H9N2亞型禽流感的免疫程序，也未見系統(tǒng)開展山雞H9N2亞型禽流感免疫抗體消漲規(guī)律研究的報(bào)導(dǎo)，免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。為此，筆者根據(jù)多年從事山雞養(yǎng)殖和各類疫病防控的經(jīng)驗(yàn)，開展了針對種山雞一個(gè)世代的H9N2亞型禽流感免疫與抗體效價(jià)的評估試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)試驗(yàn)山雞。上海某珍禽育種有限公司1日齡祖代種山雞苗雛1萬羽，2016年7月2日出雛；其入孵種蛋為43周齡健康種母山雞所產(chǎn)，并嚴(yán)格按照孵化流程入孵。該批試驗(yàn)山雞的種母雞(43周齡)其時(shí)已按家禽免疫程序分別于33日齡、69日齡和125日齡實(shí)施H9N2亞型禽流感滅活疫苗免疫。

(2)免疫疫苗。禽流感滅活疫苗(H9N2亞型，F(xiàn)株)；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批準(zhǔn)文號:獸藥生字(2015)150132066；批號：160190405；有效期：2017年06月23日。

(3)檢測試劑。①抗原：禽流感病毒H9N2亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原，生產(chǎn)商：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，批號：2017001。②標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：禽流感病毒H9N2亞型血凝抑制試驗(yàn)陽性對照血清，生產(chǎn)商：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，批號：2016001。③標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：禽流感病毒H9N2亞型HI試驗(yàn)陰性對照血清，生產(chǎn)商：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號：2016003。④紅細(xì)胞：1%雞紅細(xì)胞懸液：采集無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞全血，與等體積阿氏液混合，用pH值7.2、0.01moL/L PBS液洗滌3次，每次均以2 500～3 000 rpm/min離心5 min，洗滌后用PBS液配成1%雞紅細(xì)胞懸液，2℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

(1)試驗(yàn)山雞飼養(yǎng)。①育雛期飼養(yǎng)方式:0～35日齡為育雛期；雛山雞采用四層疊層式立體育雛籠飼養(yǎng)。②保育期飼養(yǎng)：36～55日齡為保育期，采用雙層階梯式保育籠飼養(yǎng)。③育成期飼養(yǎng):分育成前期和育成后期2個(gè)階段，其中：56～120日齡為育成前期，采用暗光照地面平養(yǎng)方式飼養(yǎng)；121日齡～開產(chǎn)(190～195日齡)為育成后期，又稱為產(chǎn)蛋準(zhǔn)備期，采用3層疊層單雞單籠式種山雞籠飼養(yǎng)。④種用期:開產(chǎn)～淘汰(一般持續(xù)種用至56周齡全群淘汰)為種用期。采用3層疊層單雞單籠式種山雞籠飼養(yǎng)。

(2)免疫。根據(jù)家禽H9N2亞型禽流感推薦免疫程序，結(jié)合山雞生理特性和飼養(yǎng)特點(diǎn)，試驗(yàn)沿用該公司原先使用的免疫程序?qū)υ囼?yàn)山雞全群進(jìn)行H9N2亞型禽流感免疫，詳見表1。

表1 H9N2亞型禽流感滅活疫苗免疫情況匯總表

(3)采樣與樣品處理。①種母山雞采樣：對該批試驗(yàn)山雞的種母山雞，在留取種蛋(43周齡)時(shí)隨機(jī)采取20份血液樣品。②育雛期采樣：對剛出殼0日齡雛山雞，隨機(jī)抽取20羽苗雛采血；以后每隔10 d隨機(jī)抽取20羽雛山雞采取血樣，共采集0日齡、10日齡、20日齡、30日齡等4個(gè)批次、80份血樣。由于雛山雞體型偏小，此期采血可取心臟采血的方法或直接頸動(dòng)脈放血采樣。③育成期及后續(xù)樣品采集：試驗(yàn)山雞在轉(zhuǎn)群至育成期飼養(yǎng)后的第60日齡時(shí)隨機(jī)采取20份血樣，以后每隔30 d在試驗(yàn)山雞群中隨機(jī)采取20份血樣，共采集60日齡、90日齡、120日齡、150日齡和180日齡等5個(gè)批次共100份育成期青年山雞的血樣；種山雞開產(chǎn)后分別采取210日齡、240日齡、270日齡、300日齡和330日齡等5個(gè)批次、100份種山雞血樣。④樣品處理與保存：整個(gè)試驗(yàn)共采集試驗(yàn)山雞14個(gè)批次、280份血液樣品和43周齡種母山雞1個(gè)批次、20份血液樣品，總數(shù)為15個(gè)批次、300份血液樣品；每個(gè)批次樣品在采集后立即分離血清，標(biāo)記后冷凍保存；至全部15個(gè)批次血樣全部采集完成后集中監(jiān)測。

(4)樣品檢測。①抗體檢測：按照國標(biāo)(GB/T 18936-2003)《H9N2亞型禽流感診斷技術(shù)》中血凝和血凝抑制試驗(yàn)的方法進(jìn)行操作。②評定標(biāo)準(zhǔn)：所有300份血清樣品在同一時(shí)間采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)同步進(jìn)行H9N2亞型禽流感抗體檢測；HI滴度效價(jià)≥4 log2判為抗體合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

(1)種母山雞抗體檢測結(jié)果。種母山雞43周齡1個(gè)批次的20份血樣，采用HI方法檢測，HI均值為9.0log2,檢測結(jié)果分類匯總見表2。

表2 種母山雞20份樣品HI方法檢測結(jié)果分類匯總表

(2)試驗(yàn)山雞抗體檢測結(jié)果。試驗(yàn)山雞14個(gè)批次共280份樣，采用HI方法同時(shí)檢測，各批次HI平均值匯總結(jié)果見表3和圖1。

表3 試驗(yàn)山雞14個(gè)批次免疫抗體HI均值

圖1 試驗(yàn)山雞14個(gè)批次樣品免疫抗體HI均值折線圖

(3)試驗(yàn)山雞抗體陽性合格結(jié)果。14批次280份試驗(yàn)山雞血樣的抗體陽性合格率匯總結(jié)果見表4和圖2。

表4 試驗(yàn)山雞14個(gè)批次樣品免疫抗體陽性合格率匯總表

圖2 試驗(yàn)山雞14個(gè)批次樣品免疫抗體陽性合格率折線圖

2.2 分析

(1)種母山雞抗體檢測結(jié)果分析。分析表2發(fā)現(xiàn)：種母山雞20份血樣的HI值全部合格，且平均值達(dá)9.0log2，其中HI值大于8log2有19份，說明種母山雞的H9亞型禽流感免疫抗體水平較高，可有效保護(hù)群體抵御野毒侵襲。

(2)試驗(yàn)山雞母源抗體分析。分析表3和圖1可以看到：0日齡樣品的H9抗體檢測HI均值高達(dá)8.45log2，說明試驗(yàn)山雞較好地獲得了親本的母源抗體，而且在隨后的10、20、30日齡等三批樣品的母源抗體也一直維持在6log2以上的較高抗體水平，可較長時(shí)間有效保護(hù)試驗(yàn)山雞在育雛期免受野毒侵襲。

(3)試驗(yàn)山雞免疫抗體分析。33日齡采用H9N2亞型滅活疫苗首免后，試驗(yàn)山雞抗體水平快速提升至12 log2，并隨著69日齡和125日齡的二次加強(qiáng)免疫，試驗(yàn)山雞的抗體水平持續(xù)升高，并在150日齡時(shí)達(dá)到14.25log2的高峰值，且維持時(shí)間較長，在240日齡時(shí)的抗體HI均值仍達(dá)到10.25log2。

但在270日齡時(shí)試驗(yàn)山雞的免疫抗體有一個(gè)異常反彈，HI均值達(dá)到了13.55log2，比上一批樣品的HI均值提高了3.3個(gè)

數(shù)量級，而此期試驗(yàn)山雞未開展任何相關(guān)免疫，雞群也未見任何異常。提示試驗(yàn)雞群可能受到H9亞型禽流感的野毒侵襲，但由于群體高水平的免疫抗體有效保護(hù)了試驗(yàn)山雞免受損害。

(4)試驗(yàn)山雞抗體陽性合格率結(jié)果分析。分析表4發(fā)現(xiàn)，在本次試驗(yàn)山雞14個(gè)批次280份樣品的H9亞型禽流感抗體HI檢測結(jié)果中，僅有3份樣品的抗體水平為陰性，其它均為陽性合格樣品，陽性合格率達(dá)到了98.8%。說明試驗(yàn)山雞H9亞型禽流感的群體免疫水平很高。其中3份不合格樣品均在育雛期，分別是10日齡批次2份、30日齡批次1份，這是母源抗體消退后的正?，F(xiàn)象。在33日齡首免后，所有樣品均達(dá)到陽性合格標(biāo)準(zhǔn)，且抗體水平遠(yuǎn)超5log2的臨界值。從圖2可以看到，在10日齡和30日齡有二個(gè)較小的低谷值外，整個(gè)試驗(yàn)期其他批次的抗體陽性合格率均為100%的高峰值。

3 討論

(1)試驗(yàn)結(jié)果證明：H9亞型禽流感母源抗體有較好的遺傳性，親本種山雞的高水平抗體可較好地遺傳給子代并在育雛期內(nèi)得到有效保護(hù)。

(2)H9亞型禽流感滅活疫苗對山雞具有較好地免疫源性，

實(shí)施免疫后的抗體上升快、效價(jià)高、維持時(shí)間長。

(3)根據(jù)本次試驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果，建議在生產(chǎn)實(shí)踐中，可適當(dāng)延后H9亞型禽流感滅活疫苗的首免時(shí)間，并減少一次加強(qiáng)免疫。推薦免疫程序見表5。

表5 H9亞型禽流感推薦免疫程序

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