木糖葡萄球菌發(fā)酵對(duì)海鱸魚魚肉理化性質(zhì)的影響

高繼慶，趙云平，秦華偉，孫玉增

（山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264006）

發(fā)酵魚制品歷史悠久，起初是作為一種傳統(tǒng)的保存魚肉的加工方式而被東南亞地區(qū)的人們所應(yīng)用。發(fā)酵不僅使魚制品具有獨(dú)特風(fēng)味，而且延長(zhǎng)了魚肉的保質(zhì)期，因而受到大眾喜愛。

目前，全國各地具有多種多樣的發(fā)酵魚制品，如魚糜制品、魚塊制品、魚米制品、發(fā)酵整魚及各種發(fā)酵調(diào)味品，菲律賓的Balaobalao，泰國的Somfug為發(fā)酵魚糜制品，韓國Changran-jeot，印度尼西亞的Bekasam為發(fā)酵整魚制品，而魚露、日本的Shottsuru和老撾的Nam-pla等都是發(fā)酵調(diào)味品。這些種類的發(fā)酵魚制品多采用自然發(fā)酵的方式制成，但由于原料的不同，使得每種發(fā)酵制品的風(fēng)味差異大，產(chǎn)品品質(zhì)難以控制，發(fā)酵周期也較長(zhǎng)[1]。如今人們?cè)絹碓絻A向于接種微生物發(fā)酵劑的方式發(fā)酵魚制品，不僅可提高安全性、縮短發(fā)酵周期，還可增加發(fā)酵過程的可控性，使發(fā)酵過程更為標(biāo)準(zhǔn)化。

木糖葡萄球菌被廣泛應(yīng)用于魚制品發(fā)酵過程中，但并不是所有菌株的發(fā)酵特性均相同，發(fā)酵后魚制品的品質(zhì)會(huì)因菌種的不同而有所差異。目前研究表明，利用木糖葡萄球菌發(fā)酵魚制品后，魚肉在質(zhì)構(gòu)、感官上均有明顯改善。前期研究中對(duì)發(fā)酵后魚肉中過敏原蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后肌漿蛋白水解，并出現(xiàn)輕微氧化。魚肉蛋白質(zhì)不僅包括肌漿蛋白，還包括肌原纖維蛋白，肌原纖維蛋白對(duì)于發(fā)酵后魚肉的質(zhì)構(gòu)起著重要作用，因而有必要對(duì)發(fā)酵過程中肌原纖維蛋白的變化進(jìn)行研究。

魚肉質(zhì)構(gòu)改變的主要原因是肌肉蛋白在發(fā)酵過程中發(fā)生一系列物理化學(xué)變化。由于木糖葡萄球菌產(chǎn)酸，pH值的降低可誘導(dǎo)魚肉形成酸凝膠，質(zhì)構(gòu)發(fā)生改變，而蛋白質(zhì)的水解、變性聚集等因素，同樣對(duì)魚肉質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響。前者往往有利于質(zhì)構(gòu)的增強(qiáng)[2-3]，而后者的研究結(jié)果不一。蛋白質(zhì)變性后，蛋白分子之間的作用力改變，包括疏水作用、二硫鍵、氫鍵、靜電作用等。目前，針對(duì)蛋白質(zhì)變性的研究多集中在二硫鍵和疏水相互作用的影響，因此需要對(duì)肌肉蛋白質(zhì)尤其是肌原纖維蛋白在發(fā)酵過程中的基團(tuán)及疏水性變化進(jìn)行檢測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

1.1.1 TCA-溶解肽試劑

（1） 雙縮脲試劑。準(zhǔn)確稱取3 g酒石酸鉀鈉和0.75 g硫酸銅，溶于250 mL蒸餾水中,一邊攪拌一邊加入150 mL的10%（W/V） NaOH，用水稀釋至500 mL后儲(chǔ)存于塑料瓶中。

（2） 10%（W/V） NaOH溶液。稱取25 g NaOH，溶于250 mL蒸餾水中。

（3）BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g牛血清蛋白，配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.1.2 羰基測(cè)定試劑

（1） 10 mmol/L的DNPH溶液。準(zhǔn)確稱取0.396 2 g DNPH，溶于50 mL 2 mol/L鹽酸中，定容至200 mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

（2） 20%（W/V）TCA溶液。準(zhǔn)確稱取20 g TCA，80 mL超純水溶解。

（3） 6 mol/L的鹽酸胍溶液。稱取231.24 g鹽酸胍溶于超純水中，定容至200 mL。

1.1.3 TBARS試劑

（1） 提取液。5×10-6mol/L沒食子酸丙酯，2×6×10-6mol/L EDTA，0.2 mol/L三氯乙酸水溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pH值測(cè)定

發(fā)酵過程中海鱸魚pH值的測(cè)定參考Riebroy S等人[4]的方法并略作修改。于0～60 h的發(fā)酵過程中每間隔12 h定時(shí)取樣。每次取5 g魚肉樣品，加入45 mL蒸餾水中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min均質(zhì)1 min，然后用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定。

1.2.2 木糖葡萄球菌菌落數(shù)測(cè)定

參考Riebroy S等人[4]的方法并略作修改，每次取樣后取魚肉5 g，加入45 mL已滅菌的生理鹽水，均質(zhì)，振搖30 min后梯度稀釋，選取3個(gè)合適梯度的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基，于30℃條件下培養(yǎng)48 h，每個(gè)梯度稀釋液做3個(gè)平行。

1.2.3 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

采用質(zhì)地剖面分析（TPA） 方法進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析[5]。使用以下分析條件為扁平圓柱形金屬探針（P/5）壓縮樣品至原始尺寸的50%，預(yù)分析速度30 mm/min，測(cè)試和后分析速度均為60 mm/min，以及5 s內(nèi)連續(xù)按壓時(shí)間。測(cè)試和分析在室溫20±1℃下進(jìn)行。用刀從魚背部區(qū)域手動(dòng)切除沒有皮膚的魚片（5 cm×3 cm×1 cm） 用于紋理測(cè)量。使用TMS2000系統(tǒng)（食品技術(shù)公司）處理數(shù)據(jù)，該系統(tǒng)產(chǎn)生凝聚性、硬度、彈性、抗性和咀嚼性的信息。將從每個(gè)樣品的4個(gè)不同區(qū)域獲得的所有測(cè)量數(shù)據(jù)平均，以獲得最終值，4個(gè)不同的區(qū)域均勻分布在魚片上。

1.2.4 游離氨基酸含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取適量的樣品于15 mL的離心管中，加0.02 mol/L的鹽酸5 mL混勻5 min，超聲提取5 min，提取結(jié)束后避光環(huán)境下靜置2 h。靜置結(jié)束后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，移取上清液1 mL，向上清液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的磺基水楊酸1 mL，振蕩渦旋1 min，避光環(huán)境下靜置1 h，靜置結(jié)束后以轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心15 min，取500 μL上清液，準(zhǔn)確加入250 μL的1 mol/L三乙胺乙腈溶液，混勻后加入250 μL的0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，混勻，于室溫下靜置1 h，加入2 mL正己烷，劇烈振搖，靜置10 min，0.22 μm的水相膜過濾下層溶液，上機(jī)分析。

色譜柱：LCA K07/Li，進(jìn)樣量50 μL。檢測(cè)條件：檢測(cè)波長(zhǎng)570，440 nm；茚三酮流速0.25 mL/min；流動(dòng)相流速0.45 mL/min；反應(yīng)器溫度130℃。

1.2.5 TCA-溶解肽測(cè)定

參考Visessanguan W等人[6]的方法，將3g樣品加入到27 mL冷的5%（W/V）TCA溶液中。勻漿該混合物1 min并在冰上保持1 h，隨后以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min。測(cè)量上清液中的寡肽含量。TCA-溶解肽含量用μmol Tyr/g表示。

1.2.6 TBARS測(cè)定

參考S?rensen G等人[7]的方法并略做改動(dòng)。取15 g魚肉與30 mL提取液混合均質(zhì)，然后在4℃條件下，以轉(zhuǎn)速4 000r/min離心15 min，離心后取5 mL上清液與5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混合，封蓋，置于沸水中水浴1 h。然后室溫冷卻20 min，于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度，空白是5 mL水中加5 mL TBA溶液，TBA值的計(jì)算根據(jù)丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著水平為p<0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 pH值和木糖葡萄球菌菌落數(shù)變化

發(fā)酵過程中pH值和木糖葡萄球菌菌落數(shù)變化見圖1。

圖1 發(fā)酵過程中pH值和木糖葡萄球菌菌落數(shù)變化

對(duì)發(fā)酵過程中魚肉中的木糖葡萄球菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，繪制如圖1所示曲線。從圖1中可以看出，木糖葡萄球菌初始接種量為5.46 lg CFU/g，隨發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，菌落數(shù)不斷增加（p<0.05），36 h時(shí)菌落數(shù)增至9.10 lg CFU/g，此后則基本保持穩(wěn)定。

pH值反映了經(jīng)過微生物發(fā)酵作用后，魚肉中游離態(tài)氫離子的濃度，pH值的降低可以導(dǎo)致魚肉蛋白結(jié)構(gòu)改變。由圖1可知，魚肉初始pH值為6.7左右，發(fā)酵過程中不斷下降，最終在發(fā)酵60 h時(shí)降至4.8。較低的pH值不僅有利于防腐，還可以改善風(fēng)味，提高發(fā)酵魚制品的安全性，同時(shí)較低的pH值可增強(qiáng)魚肉組織中的酸性蛋白酶活性。但有研究表明[8]，采用木糖葡萄球菌和植物乳桿菌作為發(fā)酵劑發(fā)酵臘腸時(shí)，pH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，原因可能是發(fā)酵后期微生物生成較多的胺類和多肽，對(duì)于產(chǎn)生的有機(jī)酸起到了一定的緩沖作用，中和了有機(jī)酸。

3.2 質(zhì)構(gòu)

不同發(fā)酵時(shí)間魚肉質(zhì)構(gòu)變化見表1。

魚的種類、不同發(fā)酵條件和加工方式都會(huì)對(duì)發(fā)酵制品的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響。魚肉發(fā)酵過程中，pH值降低有利于魚肉形成酸誘導(dǎo)凝膠[3]。對(duì)魚肉進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析是通過質(zhì)構(gòu)儀模擬人口腔咀嚼食物的過程，其中硬度和彈性反映人的感官適口性，體現(xiàn)了魚肉形成凝膠的程度，咀嚼性體現(xiàn)了發(fā)酵后魚肉在食用時(shí)所需的能量[9]。由表1可以看出，硬度、咀嚼性、膠黏性明顯增加（p<0.05），而彈性和內(nèi)聚性變化不顯著（p＞0.05）。Zeng X等人[10]在研究中國傳統(tǒng)酸魚時(shí)也發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的酸魚比發(fā)酵前的黏性、硬度和咀嚼性增加，彈性和回復(fù)力沒有明顯區(qū)別。朱雯娟等人[11]研究表明，添加混合發(fā)酵劑發(fā)酵梅香魚可以明顯改善魚肉彈性。Visessanguan W等人[6]在研究泰國一種發(fā)酵香腸Nahm時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵0～36 h時(shí)Nahm硬度、脆性、彈性、內(nèi)聚力均迅速增加，但發(fā)酵36 h后變化不明顯（p＞0.05），并分析Nahm質(zhì)構(gòu)的改變主要是由于發(fā)酵過程中緩慢降低的pH值改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能特性，形成了酸誘導(dǎo)的蛋白凝膠。Xu Y等人[12]認(rèn)為，pH值變化可以影響凝膠形成是因?yàn)?，蛋白質(zhì)氨基酸殘基側(cè)鏈上的電荷分布發(fā)生改變，因而影響了凝膠形成。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間魚肉質(zhì)構(gòu)變化

發(fā)酵60 h時(shí)，魚肉膠黏性、咀嚼性和硬度與發(fā)酵48 h相比均有不同程度下降，推測(cè)可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中蛋白質(zhì)發(fā)生氧化[13]或者蛋白質(zhì)和脂肪不斷被分解成小分子物質(zhì)[14]，從而導(dǎo)致了凝膠結(jié)構(gòu)變得疏松。

目前，已報(bào)道的魚肉形成凝膠的方式有加熱、酶交聯(lián)、高壓、酸化等，試驗(yàn)中發(fā)酵后魚肉質(zhì)構(gòu)特性增強(qiáng)的主要原因是木糖葡萄球菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酸。但并不是所有的酸都可以誘導(dǎo)肉制品形成酸凝膠，如Venugopal V等人[15]發(fā)現(xiàn)，醋酸和乳酸能夠誘導(dǎo)鯊魚蛋白形成凝膠，而檸檬酸、酒石酸則不能形成酸凝膠。同時(shí)，并非所有魚類均可形成酸凝膠，與淡水魚相比，海水魚更易形成酸凝膠，而發(fā)酵魚制品的質(zhì)構(gòu)特性也會(huì)因魚的種類和發(fā)酵條件的不同而有所差別[16]。

3.3 游離氨基酸

發(fā)酵后游離氨基酸變化見表2。

由于微生物及組織蛋白酶的雙重作用，魚肉蛋白在發(fā)酵時(shí)不斷水解，使得游離氨基酸含量不斷上升[17]。從表2可以看出，共有17種氨基酸被檢測(cè)，游離氨基酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加。這表明，魚肉蛋白質(zhì)逐漸被水解，生成了大量氨基酸。發(fā)酵60 h后，氨基酸含量由未發(fā)酵的914.2 mg/100 g增加至1 472.5 mg/100 g，增加了 61.07%。Zeng X[10]和Yang F等人[18]的研究也發(fā)現(xiàn)，與發(fā)酵前相比，魚肉發(fā)酵后氨基酸含量顯著增加。

表2 發(fā)酵后游離氨基酸變化/mg·（100 g）-1

但并不是所有種類的游離氨基酸含量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，Thr，Ser，Ala，Met，Leu，His等氨基酸含量總體呈上升趨勢(shì)，但也有的氨基酸含量變化無規(guī)律可循。有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，在發(fā)酵蠔油時(shí)，多數(shù)游離氨基酸含量上升，一些氨基酸含量處于動(dòng)態(tài)變化之中，試驗(yàn)結(jié)果與之相符。但是可以從表1中看出，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，Leu，Ala，Glu，Phe，Val，Lys 含量較高，達(dá)到總量的57.49%。一般谷物類缺乏賴氨酸，而試驗(yàn)中發(fā)酵后魚糜中賴氨酸含量顯著上升，因此食用該類魚糜發(fā)酵制品可以有效改善因食用谷物而引起的賴氨酸攝入不足。

在蛋白質(zhì)降解過程中，不僅內(nèi)源酶對(duì)氨基酸的生成有明顯作用，微生物的生長(zhǎng)代謝也對(duì)氨基酸的含量變化有重要影響[20]。S.x在生長(zhǎng)代謝過程中能夠利用氨基酸，發(fā)酵36 h時(shí)魚肉中菌落數(shù)在9.10 lg CFU/g左右時(shí)，氨基酸增長(zhǎng)速率開始減緩，表明此時(shí)微生物含量增多，對(duì)氨基酸的利用率開始增加，細(xì)菌的代謝或酶解的作用，將氨基酸分解成胺類、揮發(fā)性酸和其他含氮物質(zhì)，NH3含量可作為氨基酸分解的一個(gè)指標(biāo)，表中NH3含量不斷上升，也證實(shí)了在蛋白質(zhì)降解生成大量氨基酸的同時(shí)，部分氨基酸也被微生物分解利用，此結(jié)論與Ernestinam P等人[21]的研究結(jié)果一致。

3.4 TCA-溶解肽

發(fā)酵過程中TCA-溶解肽變化見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中TCA-溶解肽變化

試驗(yàn)測(cè)得的魚肉TCA-溶解肽含量如圖2所示，未發(fā)酵時(shí)測(cè)得的 TCA-溶解肽含量為 2.22 μmol Tyr/g，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，TCA-溶解肽不斷增加，尤其在發(fā)酵36 h后，TCA-溶解肽含量增長(zhǎng)速率最快，發(fā)酵60 h后增加至8.09 μmol Tyr/g，比未發(fā)酵增加了2.6倍。蛋白質(zhì)降解使得游離氨基酸和TCA-溶解肽的含量上升[6]，試驗(yàn)中TCA-溶解肽含量不斷增加和氨基酸含量不斷升高均證實(shí)了這一結(jié)論，這表明發(fā)酵過程中組織內(nèi)源酶和微生物的作用將肌漿蛋白和肌原纖維蛋白降解。目前眾多的研究表明，pH值的降低能夠增強(qiáng)魚肉蛋白酶活性，尤其是魚肉的組織內(nèi)源酶活性[22]。

值得指出的是，風(fēng)味物質(zhì)的形成是由于蛋白質(zhì)降解生成一些低分子量的化合物，如有機(jī)酸、多肽、氨基酸等[4]，這些化合物賦予發(fā)酵后魚制品特殊的風(fēng)味和香味。試驗(yàn)證實(shí)發(fā)酵過程中有大量氨基酸和低分子肽生成，因而可以推測(cè)木糖葡萄球菌發(fā)酵可能增加了發(fā)酵后魚肉的風(fēng)味。

3.5 TBARS

發(fā)酵過程中魚肉TBARS含量變化見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中魚肉TBARS含量變化

脂肪氧化過程中產(chǎn)生的氫過氧化物能夠進(jìn)一步分解生成低分子的醛酮類物質(zhì)，其中最具代表性的為丙二醛，它是最主要的脂質(zhì)氧化的次級(jí)產(chǎn)物[23]，丙二醛與α-硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅色復(fù)合物，該復(fù)合物于波長(zhǎng)532 nm處的吸光度即為TBARS值[24]。由圖3所示，發(fā)酵過程中魚肉TBARS值不斷上升，發(fā)酵至60 h時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)TBARS為2.31 mg/kg，并未超過魚制品可接受的最大值5 mg/kg。

已有研究表明，發(fā)酵魚過程中魚肉中的脂肪會(huì)發(fā)生氧化，TBARS值上升。脂肪氧化受多種因素影響，如魚肉化學(xué)組成、加工過程、與氧氣接觸及光的存在等，某些細(xì)菌由于自身產(chǎn)生抗氧化酶，因而對(duì)脂肪具有抗氧化作用。在試驗(yàn)中，由于木糖葡萄球菌具有過氧化氫酶活性，因此抑制了脂肪在魚肉發(fā)酵過程中的過度氧化，Chen Q等人[24]的研究也證實(shí)了木糖葡萄球菌在發(fā)酵肉制品中具有抗氧化作用。

4 結(jié)論

研究表明，隨木糖葡萄球菌發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，木糖葡萄球菌菌落數(shù)顯著增加，pH值不斷下降，pH值降低形成了酸誘導(dǎo)凝膠，魚肉硬度、咀嚼性、膠黏性明顯增加，持水性不斷下降。發(fā)酵60 h后魚肉游離氨基酸含量增加，TCA-溶解肽比未發(fā)酵時(shí)增加了2.6倍，表明發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)不斷降解，產(chǎn)生大量小分子肽和氨基酸。鹽溶性蛋白發(fā)酵后氨基含量增加，總巰基含量下降了，羰基含量增加，表明蛋白質(zhì)在降解過程中發(fā)生氧化，同時(shí)脂肪發(fā)生輕微氧化。

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