26份海州常山種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析

謝福春， 曾現(xiàn)艷， 程 瑤， 張艷君， 秦 棟， 王華田

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.煙臺(tái)新海建筑設(shè)計(jì)有限責(zé)任公司，山東煙臺(tái) 264000;3.哈爾濱理工大學(xué)榮成學(xué)院，山東榮成 264300； 4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安 271018)

海州常山(ClerodendrumtrichotomumThunb.)是馬鞭草科(Verbenaceae)大青屬(Clerodendrum)落葉小喬木或灌木，在我國(guó)華北、華東、中南和西南各省(區(qū)、市)均有分布，常見于山丘陵、荒坡溝谷等地[1]。海州常山具有花形別致，花、果觀賞價(jià)值高且觀賞期長(zhǎng)的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于城市園林綠化中，同時(shí)由于該樹種具有較強(qiáng)的抗鹽、抗旱、耐澇等特性，是干旱瘠薄荒山及礦區(qū)廢棄地植被恢復(fù)與重建、城市廢棄地綠化、鹽堿地綠化的優(yōu)良樹種。目前對(duì)于海州常山的研究多集中在繁育技術(shù)、抗逆性機(jī)制、花粉活力的測(cè)定及植物化學(xué)成分分析等方面[2-6]，而對(duì)其遺傳多樣性的研究相對(duì)較少。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)是一項(xiàng)以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有DNA用量少、多態(tài)性水平高、檢測(cè)位點(diǎn)多、分子識(shí)別率高等特點(diǎn)[7-9]，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于雞冠花、銀杏、珙桐和海棠等觀賞植物的遺傳多樣性研究[10-13]。本研究采用DNA-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)來(lái)自我國(guó)15個(gè)省(區(qū)、市)26份種源的海州常山進(jìn)行遺傳多樣性研究，從分子水平揭示我國(guó)海州常山種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平和遺傳進(jìn)化關(guān)系，為海州常山的良種選育和遺傳變異性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根據(jù)中國(guó)數(shù)字植物標(biāo)本館、《中國(guó)植物志》及其他相關(guān)文獻(xiàn)記載確定海州常山標(biāo)本采集地點(diǎn)，結(jié)合標(biāo)本采樣地點(diǎn)的地理位置和主要?dú)庀笠蜃?年均溫、日照時(shí)數(shù)、無(wú)霜期、降水量)，對(duì)海州常山種源分布進(jìn)行區(qū)域劃分，根據(jù)種源區(qū)劃確定15個(gè)省(區(qū)、市)，根據(jù)每個(gè)省(區(qū)、市)資源的分布情況，確定采集地點(diǎn)，共選取26個(gè)采集地點(diǎn)(表1)，所選采集地點(diǎn)基本覆蓋了海州常山在國(guó)內(nèi)的分布區(qū)域。采集的不同地區(qū)的海州常山種源種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)種質(zhì)資源圃，本試驗(yàn)采集的幼嫩葉片均是來(lái)自不同地區(qū)的海州常山3年生萌蘗苗。

1.2 DNA提取

每個(gè)種源從5個(gè)單株中各取2張幼嫩葉片混合取樣 50 mg，利用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[14]提取海州常山葉片基因組總DNA，采用紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量和濃度，將樣品稀釋到50 μg/mL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AFLP分析

參照Vos等的方法[15]，用EcoRⅠ+MseⅠ內(nèi)切酶組合對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，從64對(duì)AFLP引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的8對(duì)引物組合(表2)。預(yù)擴(kuò)增總反應(yīng)體系：酶切連接產(chǎn)物2 μL，Pre-AMPmix 1 μL，dNTPs 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 U/μLTaq0.5 μL，ddH2O 18 μL，共 25 μL。預(yù)擴(kuò)增PCR程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸 5 min。將PCR產(chǎn)物稀釋20倍后作為選擇性擴(kuò)增模板，選擇性擴(kuò)增體系同上。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，1個(gè)循環(huán)，然后以每次循環(huán)復(fù)性溫度逐級(jí)降低0.7 ℃的梯度繼續(xù)進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，變性和延伸條件同上，最后以94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，23個(gè)循環(huán)結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng) 95 ℃變性 10 min 后用4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測(cè)。

表1 海州常山采樣地概況

表2 海州常山熒光AFLP引物篩選中供試的64對(duì)引物組合

1.4 數(shù)據(jù)分析

用377DNA自動(dòng)檢測(cè)儀掃描電泳膠圖，用Gene Scan3.1軟件對(duì)電泳膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，通過Binthere軟件分析各片段大小。利用Excel 2007將原始數(shù)據(jù)中有帶的換成“1”，無(wú)帶的換成“0”，構(gòu)建“01”矩陣。利用POPGENE version1.31軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)：多態(tài)帶數(shù)(AP)和多態(tài)帶百分率(P)；觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)的有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性(H)。用NTSYSpc-2.11F軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)原始矩陣用Sim Qual程序求DICE相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。用SHAN程序中的非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡(jiǎn)稱UPGMA)方法進(jìn)行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類圖(圖1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

從64對(duì)引物組合中篩選出8對(duì)譜帶清晰、多態(tài)性高且穩(wěn)定的引物組合，這8對(duì)引物擴(kuò)增圖譜顯示電泳帶數(shù)目豐富，分帶清晰(圖2)。擴(kuò)增片段的大小在70～500 bp之間，且分布相對(duì)均勻。8對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1 042條條帶，其中多態(tài)性條帶1 030條，占比為的98.85%。不同引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶總數(shù)范圍在115～148條之間，平均為128.75條；不同引物組合平均多態(tài)性條帶比例為98.87%(表3)。不同引物產(chǎn)生的條帶數(shù)存在一定的差異，其中E-ACA/M-CAG引物產(chǎn)生的條帶最多，為151條，而E-AGC/M-CAG引物產(chǎn)生的條帶最少，為116條。引物組合E-AGC/M-CAG和E-AGG/M-CAA擴(kuò)增出的位點(diǎn)全部具有多態(tài)性，而引物組合 E-ACA/M-CAG的多態(tài)性位點(diǎn)的比例最低，為98.01%。以上分析表明，所選擇的引物在海州常山種源間表現(xiàn)了較高的多態(tài)性。

表3 AFLP選擇性擴(kuò)增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性

采用POPGENE軟件對(duì)不同引物組合對(duì)海州常山的遺傳多樣性進(jìn)行分析。由表4可知：26份海州常山種質(zhì)資源平均觀測(cè)等位基因數(shù)為1.562 5個(gè)，平均有效等位基因數(shù)為 1.226 0個(gè)，平均Nei’s基因多樣性、平均香農(nóng)信息指數(shù)分別為0.142 0、0.225 5，以上數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)海州常山的多態(tài)性豐富，種源間的遺傳多樣性較高，存在豐富的變異。

2.2 不同海州常山種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)分析

采用NTSYSpc 2.10軟件計(jì)算種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)(表5)，結(jié)果顯示，來(lái)自不同地區(qū)的26份海州常山的遺傳相似系數(shù)在0.285 1～0.690 9之間，平均為0.518 0。其中山東泰安馬套村和泰安夏張鎮(zhèn)2個(gè)種源間的相似系數(shù)最大(0.690 9)，甘肅天水和云南昭通間的相似系數(shù)最低(0.285 1)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，遺傳相似系數(shù)在0.400 0～0.600 0之間的占種源總數(shù)的81.58%；遺傳相似系數(shù)小于0.400 0的占7.69%；遺傳相似系數(shù)大于0.600 0的占10.46%。另外從相似系數(shù)矩陣可知：來(lái)自同一省份或者相近地域的種源之間相似系數(shù)較大，例如來(lái)自山東省、河南省、江蘇省的種源之間相似系數(shù)偏高。由遺傳相似系數(shù)分析可知，供試材料之間的遺傳相似性與地理距離存在顯著的相關(guān)性，地理距離越遠(yuǎn)，遺傳相似性越小，遺傳距離越大，基因間的交流越少。反之，遺傳相似性越大，材料間的遺傳距離越小，基因交流越頻繁。

表4 基于不同引物組合的海州常山遺傳多樣性水平

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。

2.3 不同海州常山種質(zhì)資源的聚類分析

根據(jù)相似性系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，在相似系數(shù)為0.534處可以將所有種源海州常山劃分為7類(圖1)：第一類包括2個(gè)種源，分別為山西太原和甘肅天水，第二類陜西楊凌單獨(dú)為一類，第三類包括19份種質(zhì)資源，在相似性系數(shù)0.57處切割?？蓪⒌谌惾簞澐譃?個(gè)亞群(A、B、C、D)，A亞群包括11個(gè)種源，其中在11份種源中，山東的占有8份，其他3份分別為山東省周邊省份；B亞區(qū)包括1份種源，為遼寧大連；C亞區(qū)包括3份種源，分別為安徽舒城、江蘇連云港、江蘇南京；D亞區(qū)包括4份種源，分別為湖北神農(nóng)架、河南新縣、河南西峽、浙江天目山。廣西臨桂縣、云南昭通、重慶金佛山、貴州望謨這4個(gè)種源可能由于分別地處熱帶和亞熱帶的交界、熱帶、亞熱帶、亞熱帶，加上地理位置相差較大，在聚類圖上分別單獨(dú)聚為一類。

3 討論

3.1 AFLP標(biāo)記的檢測(cè)有效性及海州常山的遺傳多樣性分析

在植物遺傳多樣性研究中AFLP標(biāo)記技術(shù)已在農(nóng)作物、花卉、樹木等植物中廣泛應(yīng)用[16-18]。例如野生扁蓿豆[19]、雞冠花[10]、枸杞[20]、紫椴[21]等植物遺傳多樣性的研究都采用AFLP標(biāo)記技術(shù)。本研究篩選出8對(duì)AFLP引物對(duì)26份來(lái)自不同地理區(qū)域的海州常山進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出1 042條帶，其中多態(tài)性條帶1 030條，多態(tài)性位點(diǎn)比例98.85%。另由多樣性參數(shù)可知：Na為1.562 5個(gè)，Ne為1.226 0個(gè)，H、I分別為 0.142 0、0.225 5，這與紫椴、甘蔗[21-22]等作物的研究類似，表明26份海州常山種質(zhì)間有豐富的遺傳多樣性，這為海州常山的資源開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。植物的遺傳多樣性水平與其生物學(xué)特性、環(huán)境、分布范圍、花粉和種子傳播方式等因素有關(guān)[23]，本試驗(yàn)中的26份種源遺傳多樣性豐富，可能是由于種源采自全國(guó)不同地區(qū)，這充分表明我國(guó)海州常山種質(zhì)資源具有豐富的遺傳基礎(chǔ)。

3.2 國(guó)內(nèi)主要分布區(qū)的海州常山親緣關(guān)系分析

在來(lái)自不同地區(qū)的26份海州常山種質(zhì)資源中，其相似系數(shù)在0.285 1～0.690 9之間，來(lái)自不同省份的海州常山種質(zhì)資源間相似系數(shù)相對(duì)較小，這一趨勢(shì)與對(duì)紫花苜蓿[24]、白花泡桐[25]、甘蔗[22]種質(zhì)資源間遺傳相似系數(shù)的分析相似，可知來(lái)自不同省(區(qū)、市)的海州常山種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，基因交流較少。聚類分析表明，劃分類群與地理起源明顯相關(guān)，例如來(lái)自山東、河南、江蘇各地區(qū)的種源多數(shù)聚為一類或者聚為一亞類，而來(lái)自地理距離較大的廣西臨桂縣、云南昭通、重慶金佛山、貴州望謨這4個(gè)種源各自單獨(dú)聚為一類，表明這4個(gè)種源與其他材料間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳特性。親本間的親緣關(guān)系在很大程度上決定著后代群體的選擇范圍，通常認(rèn)為2個(gè)親本遺傳差異越大，后代分離范圍就越廣泛，獲得優(yōu)良個(gè)體的機(jī)會(huì)也就越多。從聚類分析可知，地理位置分布差異較大的幾個(gè)海州常山種源可考慮作為雜交親本，為海州常山今后育種提供科學(xué)依據(jù)。

由于對(duì)海州常山種質(zhì)資源的多樣性研究剛剛開始，本研究在海州常山種質(zhì)資源多樣性研究中存在一些不足，例如不同地區(qū)采樣的數(shù)量不均，而且本試驗(yàn)只用了AFLP技術(shù)，簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱SSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱SRAP)等分子標(biāo)記技術(shù)還未用于海州常山種質(zhì)資源的遺傳多樣性的分析。下一步將采集樣品較少地區(qū)的種質(zhì)資源，并采用其他分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，尋找適宜該樹種遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)一步確定海州常山不同地區(qū)種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭萬(wàn)鈞. 中國(guó)樹木志[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2004：4796.

[2]林燕青，楊秀蓮，王良桂. 海州常山花粉活力測(cè)定及其萌發(fā)條件[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，43(5)：94-99.

[3]劉 軍，曾德靜，王 鋮，等. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)海州常山硬枝扦插生根的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40(8)：10-15.

[4]張 穎，楊 舸. 微波提取法優(yōu)選海州常山葉總黃酮的提取工藝[J]. 北方園藝，2016(10)：118-122.

[5]謝福春，陳才業(yè)，劉富強(qiáng)，等. 土壤鹽脅迫對(duì)海州常山形態(tài)與氣體交換特性的影響[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26(2)：176-181.

[6]謝福春，張文婷，王華田，等. 土壤鹽脅迫對(duì)海州常山生理生化特性的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(5)：839-844.

[7]Nei M，Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics[M]. New York：Oxford University Press，2000：87-88.

[8]王玉山，邢世巖，唐海霞，等. 側(cè)柏種源遺傳多樣性分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2011，47(7)：91-96.

[9]周延清. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：164.

[10]張西西，李 俊，趙正楠，等. 26份雞冠花遺傳資源親緣關(guān)系的AFLP分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，21(3)：67-74.

[11]王 萱，劉曉靜，邢世巖，等. 中國(guó)部分古銀杏資源遺傳多樣性的AFLP分析及核心種質(zhì)的構(gòu)建[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43(2)：249-260.

[12]李雪萍，李在留，賀春玲. 珙桐遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39(5)：992-998.

[13]沈紅香，趙天田，宋婷婷，等. 觀賞海棠‘王族’自然雜交后代的遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38(11)：2157-2168.

[14]Doyle J J，Doule J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bull，1987，19(1)：11-15.

[15]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research，1995，23(21)：4407-4414.

[16]王曉醒，李淑娟，謝永麗，等. 梭羅草AFLP體系優(yōu)化及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(16)：37-41.

[17]高金秋，周建朝，王孝純，等. 部分高抗低磷脅迫基因型甜菜AFLP指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(6)：36-38.

[18]李建武，李灝德，文國(guó)宏，等. 馬鈴薯EcoRⅠ/MseⅠ內(nèi)酶切組合AFLP反應(yīng)體系的優(yōu)化與引物篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(15)：25-29.

[19]李鴻雁，李志勇，辛 霞，等. 野生扁蓿豆種質(zhì)資源AFLP遺傳多樣性的分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2016，17(1)：78-83.

[20]王錦楠，陳進(jìn)福，陳武生，等. 柴達(dá)木地區(qū)野生黑果枸杞種群遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，39(10)：1003-1011.

[21]王東升，辛 紅，邢世巖，等. 山東省紫鍛遺傳多樣性AFLP分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，43(1)：45-48.

[22]咎逢剛，應(yīng)雄美，吳才文，等. 98份甘蔗種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(5)：1002-1010.

[23]王洪新，胡志昂. 植物的繁育系統(tǒng)、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性保護(hù)[J]. 生物多樣性，1996，4(2)：92-96.

[24]劉青松，陳立波，李志勇，等. 基因組DNA分子標(biāo)記在紫花苜蓿遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，28(增刊1)：36-40.

[25]李海英，茹廣欣，侯 婷，等. 12個(gè)白花泡桐種源的遺傳多樣性分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，49(6)：764-768.