伊曲康唑抑制小鼠樹突狀細(xì)胞遷移及MMP-2、MMP-3、MMP-12與RANTES的分泌

鄭曉麗 梁官釗 史冬梅 沈永年 劉維達(dá) 陳官芝

伊曲康唑(itraconazole, ITZ)屬三唑類抗真菌藥，在臨床真菌病治療中廣泛應(yīng)用。近年研究顯示，伊曲康唑存在免疫調(diào)節(jié)作用，對掌跖膿皰病、扁平苔蘚及特應(yīng)性皮炎等皮膚病存在治療作用[1-4]，機(jī)制尚不清楚。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是目前已知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答啟動、進(jìn)展及免疫調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DCs參與炎癥反應(yīng)，與趨化因子RANTES等[5]和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)等[6]表達(dá)密切相關(guān)，并在腫瘤、感染及皮膚病等病程中扮演重要角色。MMPs能降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，包括MMP-1～MMP-19，其中MMP-2屬于明膠酶類，MMP-3屬于基質(zhì)分解素類，MMP-12屬于其他未分類。筆者發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑可以抑制小鼠DCs RANTES表達(dá)和MMP-2、MMP-3和MMP-12分泌，顯示伊曲康唑具有免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料、藥物及儀器 細(xì)胞樹突狀細(xì)胞為小鼠骨髓來源單核細(xì)胞定向誘導(dǎo)所得。伊曲康唑、脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和二甲基亞砜購于美國Sigma公司。重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor, rmGM-CSF)購于美國Peprotech公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和RPMI1640購于美國Gibco公司，(Sigma，USA)； 細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)購于上海Yeasen公司；熒光標(biāo)記抗鼠單克隆抗體CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86、CCR7購于美國eBiosciences公司。Luminex所用試劑盒由BD PharMingen公司提供。所有加伊曲康唑的試驗均選用無脂血清進(jìn)行試驗。

1.2 DCs的獲取 C57小鼠頸椎脫臼處死，置于75%酒精浸泡3分鐘后取出。無菌取出股骨和脛骨，PBS洗滌兩次，抽取骨髓，收入15 mL離心管中；1200 rpm離心5 min,棄上清，收集沉淀的骨髓細(xì)胞；然后，細(xì)胞以2×106個細(xì)胞的密度接種于100 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中含10 mL含10%胎牛血清和20 ng/mL rmGM-CSF的RPMI 1640培養(yǎng)基。在第2天，將10 mL將含20 ng/mL rmGM-CSF RPMI 1640完全培養(yǎng)基加入板中。在第4、6天，收集一半的培養(yǎng)上清液分別離心。細(xì)胞沉淀物重新懸浮在10 mL含20 ng/mL rmGM-CSF的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基中，并倒回原板。在第8天，收獲DCs用于后面的實驗。

1.3 細(xì)胞毒性試驗 收集培養(yǎng)至第8天的DCs，以每孔2×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL RPMI 1640(含10%無脂血清、20 ng/mL rmGM-CSF、1 μg/mL LPS及不同濃度伊曲康唑)，伊曲康唑使用濃度為0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μM，處理細(xì)胞12、24、48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，37℃、5% CO2培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光度(A)值，每組5個復(fù)孔，設(shè)置空白對照，實驗重復(fù)三次。細(xì)胞存活率=(處理組細(xì)胞A 值-空白組A值)/(正常對照組細(xì)胞A -空白組A值)×100%。

1.4 Transwell檢測DCs的遷移 取培養(yǎng)至第8天的DCs，用含10%無脂血清、20 ng/mL的rmGM-CSF、1 μg/mL的LPS的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106cells/mL，上室加200 μL細(xì)胞，下室加500 μL含上述成分的培養(yǎng)基。并分別在上下室加入伊曲康唑，調(diào)整其濃度為0.25、0.5和1 μM。4 h 后取出上室，將上室內(nèi)面用棉簽擦凈，用95%甲醇固定上室細(xì)胞，收下室細(xì)胞流式細(xì)胞儀計數(shù)。上室細(xì)胞固定后結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Luminex液相芯片技術(shù)檢測細(xì)胞因子 收集培養(yǎng)至第8天的DCs，以每孔1×106的密度接種于12孔板，每孔含1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%無脂血清、20 ng/mL rmGM-CSF、1 μg/mL LPS及0.25、0.5或1 μM伊曲康唑)，同時設(shè)立對照組，培養(yǎng)12 h后，分別收集上述培養(yǎng)細(xì)胞上清；采用Luminex液相芯片技術(shù)檢測上清液中MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-12和RANTES的水平，嚴(yán)格按照其操作流程進(jìn)行檢測。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs表面分子及CCR7的表達(dá) 收集上述處理的各組DCs，制備細(xì)胞懸液(1×106cells/mL)，流式染色液洗2遍，用100 μL流式染色液重懸后，在Falcon管中加入熒光素標(biāo)記的CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86 及CCR7單克隆抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，流式染色液洗滌2次，流式細(xì)胞儀分析。同時設(shè)陰性對照管。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓單核細(xì)胞在體外分化為樹突狀細(xì)胞 小鼠骨髓單核細(xì)胞，在rmGM-CSF的誘導(dǎo)下，經(jīng)過8天的培養(yǎng)和LPS的誘導(dǎo)，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞呈半懸浮生長，表面有樹枝狀突起(見圖1a)。培養(yǎng)至第8天的DCs， CD11c 表達(dá)量高(圖1b)，說明骨髓來源單核細(xì)胞大部分已經(jīng)誘導(dǎo)分化為DCs。

圖1 a:培養(yǎng)至第8天的樹突狀細(xì)胞表面有樹枝狀突起(200×)；b:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD11c的表達(dá)

2.2 伊曲康唑?qū)Cs活力的影響 CCK-8 法檢測DCs生長抑制率，結(jié)果顯示在高濃度時伊曲康唑能明顯抑制DCs的生長(P<0.05)，伊曲康唑?qū)Cs的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，但在濃度<2 μM)時，其對細(xì)胞的抑制率增強(qiáng)不明顯，見圖2。 然而當(dāng)伊曲康唑濃度大于2 μM時，在孵育12 h后，伊曲康唑即對DCs顯示出明顯抑制作用。為了排除因細(xì)胞活力受影響造成的陽性結(jié)果，我們選用了安全范圍之內(nèi)的0.25、0.5和1 μM相互作用12 h用于后續(xù)實驗。1 μM 12 h時細(xì)胞存活率為(92.33±13.80)%，與對照組相比，細(xì)胞活力無明顯差異。而我們使用的最高濃度1 μM與臨床用量200 mg，一日兩次所達(dá)到的血藥濃度值相當(dāng)。

2.3 Transwell檢測伊曲康唑抑制了DCs的遷移 如圖3a所示，流式細(xì)胞儀計數(shù)顯示伊曲康唑抑制了DCs的遷移。倒置顯微鏡下拍照亦顯示隨著伊曲康唑濃度的升高，遷移的細(xì)胞數(shù)減少(圖3b)。與對照組相比，伊曲康唑濃度為0.5 μM時，遷移到下室的細(xì)胞比例為(1.44±0.16)%，濃度為1 μM時，遷移到下室的細(xì)胞比例為(1.42±0.13)%，與對照組(1.85±0.13)%相比，差異有顯著意義(圖4,P<0.05)。

圖2 伊曲康唑?qū)渫粻罴?xì)胞活力的影響

圖3 伊曲康唑?qū)渫粻罴?xì)胞遷移的影響 a:流式細(xì)胞儀檢測下室遷移的細(xì)胞數(shù);b:倒置顯微鏡下拍照上室外側(cè)面遷移的細(xì)胞數(shù)(100×)

圖4 流式細(xì)胞儀計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)百分比統(tǒng)計圖表(*P<0.05)

2.4 伊曲康唑抑制了MMP-2、MMP-3、MMP-12和RANTES 的分泌，對MMP-8 的分泌無明顯影響 如圖5所示，在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，MMP-2的分泌量為(351.89±8.54)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(340.415±24.77)pg/mL；濃度為1 μM時，為(325.6±6.49) pg/mL，對照組為(400.20±4.86)pg/mL，均P<0.05。對MMP-3的分泌，當(dāng)在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，MMP-3的分泌量為(112.135±10.975)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(110.23±10.79)pg/mL；濃度為1 μM時，為(90.49±0.63)pg/mL,對照組為(161.9525±13.2575) pg/mL，均P<0.05。對MMP-12的分泌，當(dāng)在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，MMP-12的分泌量為(12712±19.80)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(12903±250.32)pg/mL；濃度為1 μM時，為(12512.5±311.83)pg/mL，對照組為(13695.5±147.79)pg/mL，均P<0.05。

對RANTES的分泌，當(dāng)在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，RANTES的分泌量為(888.49±77.53)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(937.34±74.16)pg/mL；濃度為1 μM時，為(794.58±33.38)pg/mL,對照組為(1120.5±55.11)pg/mL，均P<0.05。

圖5 伊曲康唑?qū)MP2、MMP3、MMP12、RANTES、MMP8分泌的影響(*P<0.05，**P<0.01)

2.5 伊曲康唑?qū)Cs表面分子和CCR7的表達(dá)的影響 伊曲康唑處理組與對照組間CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86的表達(dá)未見顯著差異(P>0.05，數(shù)據(jù)未示)。對CCR7的表達(dá)，如圖6所示，當(dāng)伊曲康唑濃度為1 μM時，CCR7的表達(dá)量為(16.77±5.35)%，濃度為0.5 μM時，CCR7的表達(dá)量為(14.2±2.52)%，與對照組(14.4±3.73)%相比，差異均無顯著意義。

圖6 伊曲康唑?qū)渫粻罴?xì)胞CCR7表達(dá)的影響(P>0.05)

3 討論

DCs是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，它能夠顯著刺激初始T細(xì)胞增殖。未成熟DCs進(jìn)入外周組織后具有較強(qiáng)的抗原攝取和處理功能，成熟的DCs具有較強(qiáng)的抗原提呈功能并調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，與感染和免疫性疾病(銀屑病等)的發(fā)生、發(fā)展、治療和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[7]。

RANTES是CC型趨化因子，可由血小板和樹突狀細(xì)胞等分泌，主要作用于T淋巴細(xì)胞，使其趨化至皮膚中并將其活化，其還可趨化嗜酸粒細(xì)胞、人單核細(xì)胞等[8]。RANTES在銀屑病和特應(yīng)性等慢性炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展及過敏性疾病中扮演重要角色，銀屑病患者皮損處RANTES較非皮損區(qū)及正常皮膚高，其可引起皮損T淋巴細(xì)胞活化及聚集[9]。David等研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者治療后外周血RANTES水平較對照組明顯降低。并且，特應(yīng)性皮炎患者皮膚中RANTES表達(dá)升高[10]。

MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)、參與新生血管形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、激活潛在活性蛋白。MMP-2、MMP-3和MMP-12參與基質(zhì)主要成分IV型膠原的降解，對血管生成及細(xì)胞微環(huán)境調(diào)節(jié)具有重要意義[11，12]。國內(nèi)研究顯示，尋常型銀屑病患者治療后，血清中MMP-2水平降低[13-15]。Glazewska等[16]發(fā)現(xiàn)NB-UVB治療銀屑病，癥狀緩解后血清MMP-2水平隨之降低。Sawa等[17]應(yīng)用MMP-2抑制劑治療銀屑病有較好療效, 說明MMP-2是抗銀屑病藥的藥物靶位之一。 MMP-3破壞基底膜及血管壁的完整性使炎性細(xì)胞得以進(jìn)入表皮，后者再與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用，促發(fā)了其他的病理改變，這可能在銀屑病的發(fā)病早期起著一定的作用[18，19]。MMP-12可由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌，在MMP-2和MMP-3的激活過程中起重要作用[20]，與銀屑病皮損真皮乳頭層免疫細(xì)胞的浸潤相關(guān)[21]，且皮損部位MMP-12 mRNA表達(dá)水平顯著高于非皮損部位[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑顯著抑制了樹突狀細(xì)胞MMP-2、MMP-3和MMP-12的表達(dá)，這可能揭示了其部分免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

伊曲康唑抑制小鼠樹突狀細(xì)胞的遷移和MMP-2、MMP-3、MMP-12及RANTES的表達(dá)，可能為其免疫調(diào)控作用機(jī)制之一。然而，我們另有實驗發(fā)現(xiàn)伊曲康唑可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對白念珠菌的吞噬作用及抗感染免疫能力。我們初步認(rèn)為，伊曲康唑的免疫調(diào)節(jié)作用存在疾病特異性，即在不同性質(zhì)免疫細(xì)胞主導(dǎo)的疾病中其發(fā)揮的作用可能有差異，然而更深入的機(jī)制尚待探討。

[1] V’Lckova-Laskoska MT, Caca-Biljanovska NG, Laskoski DS, et al. Palmoplantar pustulosis treated with itraconazole: a single, active-arm pilot study[J]. Dermatol Ther,2009,22(1):85-89.

[2] Libow LF, Coots NV. Treatment of lichen planus and lichen nitidus with itraconazole: reports of six cases[J]. Cutis,1998,62(5):247-248.

[3] Abbas Z, Ghodsi SZ, Abedeni R. Effect of itraconazole on the quality of life in patients with moderate to severe seborrheic dermatitis: a randomized, placebo-controlled trial[J]. Dermatol Prac Concept,2016,6(3):11-16.

[4] Brouwers KJ, Vis R, Tupker RA. Itraconazole as a continuous treatment for atopic dermatitis? A case report[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol,2016,30(5):873-874.

[5] Verzura J, Ponce L, Pernia M, et al. Effect of leishmania mexicana, Rantes and TNF alpha on splenic dendritic cells of newborn and adult BALB/c mice: phenotypic characteristics and migratory properties[J]. Invest Clin,2012,53(3):237-249.

[6] Hubel J, Hieronymus T. HGF/Met-Signaling contributes to immune regulation by modulating tolerogenic and motogenic properties of dendritic cells[J]. Biomedicines,2015,3(1):138-148.

[7] Qian C, Cao X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation[J]. Semin Immunol,2018,35:3-11.

[8] Zhu K, Shen Q, Ulrich M, et al. Human monocyte-derived dendritic cells expressing both chemotactic cytokines IL-8, MCP-1, RANTES and their receptors, and their selective migration to these chemokines[J]. Chin Med J,2000,113(12):1124-1128.

[9] 唐玲，李泉，陳潔，等. RANTES在銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及其作用[J]. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2003,19(5):426-427.

[10] Giustizieri ML, Mascia F, Frezzolini A, et al. Keratinocytes from patients with atopic dermatitis and psoriasis show a distinct chemokine production profile in response to T cell-derived cytokines[J]. J Allergy Clin Immunol,2001,107(5):871-877.

[11] Mezentsev A, Nikolaev A, Bruskin S. Matrix metalloproteinases and their role in psoriasis[J]. Gene,2014,540(1):1-10.

[12] Stanciute D, Didziapetriene J, Kadziauskas J. Expression of matrix metalloproteinases in patients with malignant tumors[J]. Medicina (Kaunas),2004,40(12):1143-1150.

[13] 裘宇光. 銀屑病患者基質(zhì)金屬蛋白酶-2與基質(zhì)金屬蛋白酶-9的檢測價值[J]. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,20(11):671-672.

[14] 肖嶸，嚴(yán)開林，黃晉華，等. 基質(zhì)金屬蛋白酶在銀屑病患者皮損中的表達(dá)[J]. 中華皮膚科雜志,2004,37(10):611-612.

[15] 何秋波，李紅文，于建斌. 銀屑病患者皮損中血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)[J]. 中華皮膚科雜志,2004,37(7): 398-399.

[16] Glazewska EK, Niczyporuk M, Lawicki S, et al. Therapy of psoriasis with narrowband ultraviolet-B light influences plasma concentrations of MMP-2 and TIMP-2 in patients[J]. Ther Clin Risk Manag,2016,12:1579-1585.

[17] Sawa M, Tsukam oto T, k iyoi T, et al. New strategy for antedrug application: development of metalloproteinase inhibitors as antipsoriatic drugs[J]. J Med Chem,2002,45 (4):930 -936.

[18] McCawley LJ, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: they’re not just for matrix anymore![J]. Curr Opin Cell Biol,2001,13(5):534-540.

[19] Chandran V, Cook RJ, Edwin J, et al. Soluble biomarkers differentiate patients with psoriatic arthritis from those with psoriasis without arthritis[J]. Rheumatology, 2010,49(7):1399-1405.

[20] Matsumoto S, Kobayashi T, Katoh M, et al. Expression and localization of matrix metalloproteinase-12 in the aorta of cholesterol-fed rabbits: relationship to lesion development[J]. Am J Pathol,1998,153(1):109-119.

[21] Suomela S, Kariniemi AL, Snellman E, et al. Metalloelastase (MMP-12) and 92-kDa gelatinase (MMP-9) as well as their inhibitors, TIMP-1 and -3, are expressed in psoriatic lesions[J]. Exp Dermatol,2001,10(3):175-183.

[22] Starodubtseva NL, Sobolev VV, Soboleva AG, et al. Expression of genes for metalloproteinases (MMP-1, MMP-2, MMP-9, and MMP-12) associated with psoriasis[J]. Genetika,2011,47(9):1254-1261.