王鋼 董國(guó)偉

舌癌是我國(guó)最常見(jiàn)的口腔頜面部惡性腫瘤之一，惡性程度高，浸潤(rùn)性強(qiáng)［1］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)應(yīng)用CXCL12及其抑制劑 AMD300，作用于體外培養(yǎng)的Tca8113細(xì)胞，應(yīng)用PCR檢測(cè)Tca8113細(xì)胞表面CXCR4受體mRNA表達(dá)量;通過(guò)Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)研究該學(xué)軸對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中所發(fā)揮的作用及AMD3100對(duì)此過(guò)程的干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

舌鱗癌細(xì)胞Tca8113購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 主要材料

培養(yǎng)基 RPMI 1640、胎牛血清(杭州四季青公司);CCK-8試劑(Sigma，美國(guó));DMSO(二甲亞砜)、CXCL12因子、AMD3100、CXCR4抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Taq DNA聚合酶(Transgene)、Matrigel(BD公司，美國(guó));Transwell小室及配套孔板(Costar公司，美國(guó))等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113細(xì)胞于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，37℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)一定濃度的CXCL12及其特異性抑制劑AMD3100對(duì)Tca8113細(xì)胞CXCR4受體mRNA表達(dá)量的影響，分4組:對(duì)照組;CXCL12因子刺激組(CX組)，調(diào)整CXCL12因子的終濃度為100 ng/ml;單獨(dú) AMD3100組(AMD組)(終濃度為 1 μg/ml);AMD3100干預(yù)組(1μg/ml)，AMD3100預(yù)先孵育細(xì)胞1 h后加入終濃度為100 ng/ml CXCL12因子(AM+CX組)，干預(yù)后培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞的總RNA;按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增目的基因。

1.3.3 侵襲轉(zhuǎn)移 采用鋪有Matrigel的 Transwell小室研究Tca8113細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組同上，用含0.1%BSA的無(wú)血清RPMI 1640稀釋重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度;抽取200μl細(xì)胞懸液接種于transwell上室內(nèi)，transwell下室加入含有20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液600μl;孵育24 h，用棉簽輕輕擦掉未穿過(guò)膜的細(xì)胞及膜面的Matrigel，PBS漂洗，多聚甲醛固定，蘇木精染色15 min，流水沖洗10 min，鹽酸酒精分化2 s，自來(lái)水沖洗10 min，然后置于空氣中風(fēng)干。用手術(shù)刀將膜切下后，蓋上蓋玻片，中性樹(shù)膠封片，待過(guò)夜后干燥即可長(zhǎng)期保存。倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取膜上5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，求平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以珋x±s表示。計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，兩兩分析比較結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR

CXCR4受體 mRNA的表達(dá)量以 CXCR4受體DNA條帶灰度值和內(nèi)參照基因GAPDH的DNA條帶灰度值的比值表示(表1，圖1)。CXCR4受體基因的灰度值與內(nèi)參的灰度值的比值代表CXCR4 mRNA的表達(dá)量。

圖1 CXCR4 mRNA的表達(dá)Fig 1 CXCR4 mRNA expression of the 4 groups

表1 各組細(xì)胞CXCR4 mRNA的表達(dá)Tab 1 CXCR4 mRNA expression of the cells of the 4 groups

2.2 侵襲實(shí)驗(yàn)

體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明:CXCL12因子刺激組穿膜細(xì)胞數(shù)目最多，AMD3100預(yù)先孵育組穿膜細(xì)胞數(shù)目最少，對(duì)照組和單獨(dú)AMD3100的穿膜細(xì)胞數(shù)目差別不明顯。預(yù)先孵育CXCR4受體的拮抗劑AMD3100可以對(duì)抗CXCL12因子對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化作用，使穿膜細(xì)胞數(shù)低于CXCL12刺激組。計(jì)算趨化指數(shù)(CI)，CI=趨化因子CXCL12組平均穿膜的細(xì)胞總數(shù)/對(duì)照組平均穿膜的細(xì)胞總數(shù)，侵襲抑制率(IR)，IR=(趨化因子CXCL12組平均穿膜的細(xì)胞總數(shù)－抑制劑預(yù)先孵育組平均穿膜的細(xì)胞總數(shù))/趨化因子CXCL12組平均穿膜細(xì)胞總數(shù)×100%。

CXCL12因子刺激組穿膜細(xì)胞數(shù)目為平均(75.1±2.9)個(gè)，而AMD3100預(yù)先孵育組穿膜細(xì)胞平均數(shù)目減少為32.2 ±1.9，經(jīng) SPSS統(tǒng)計(jì)分析，CXCL12 因子刺激組與AMD3100預(yù)先孵育組的穿膜細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，單獨(dú)AMD3100組和對(duì)照組之間穿膜細(xì)胞數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2，圖2)。

表2 各組穿膜細(xì)胞數(shù)(珋x±s)Tab 2 The invaded cells throught the transwell membrane of the 4 groups(珋x±s)

3 討論

CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸是指由趨化因子CXCL12，與CXCR4互相連接而形成的一個(gè)偶聯(lián)分子對(duì)［2］，此生物學(xué)軸與多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、器官特異性轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［3－4］。

A:對(duì)照組;B:CX組;C:AMD組;D:AM+CX組圖2 4組穿膜細(xì)胞 (蘇木精染色，×100)A:Control group;B:CX group;C:AMD group;D:AM+CX groupFig 2 The invaded cells throught the transwell membrane of the 4 groups (×100)

腫瘤細(xì)胞高表達(dá)特異的趨化因子受體，而特異性的器官高表達(dá)其相應(yīng)的配體，趨化因子與其受體相互結(jié)合，導(dǎo)致出現(xiàn)癌細(xì)胞器官特異性的轉(zhuǎn)移。Muller等［5］研究顯示:涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞可檢測(cè)到，CXCR4 受體的高表達(dá)，AlmoftiA 等［6］和李五一等［7］研究結(jié)果顯示口腔鱗癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4受體。越來(lái)越多的研究證實(shí):CXCR4受體可以在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，與相應(yīng)的趨化因子相互作用，相互結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為。

為了研究證實(shí)Tca8113細(xì)胞高表達(dá)CXCR4受體，從基因水平來(lái)檢測(cè)Tca8113細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)。通過(guò)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR，基因水平檢測(cè)CXCR4受體mRNA發(fā)現(xiàn)，4組均表達(dá)CXCR4受體mRNA，刺激組最高，抑制劑AMD3100預(yù)先干預(yù)組表達(dá)量最低。這說(shuō)明正常的Tca8113細(xì)胞表面表達(dá)CXCR4受體，在CXCL12的相關(guān)作用下，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CXCR4mRNA及其翻譯表達(dá)的蛋白質(zhì)都相應(yīng)的高表達(dá)，證實(shí)了CXCR4受體在Tca8113細(xì)胞的高表達(dá)，為本實(shí)驗(yàn)研究奠定了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也觀察到單獨(dú)應(yīng)用AMD3100對(duì)CXCR4受體的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用，關(guān)于此方面的研究還很少，還需進(jìn)一步的研究探討。

Muller等［5］發(fā)現(xiàn)，趨化因子 CXCL12可以促使高表達(dá)CXCR4受體的涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞定向遷移。邱際華等［8］對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的研究結(jié)果示:CXCL12對(duì)鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，同時(shí)這種促進(jìn)作用可以被CXCR4受體的特異性拮抗劑AMD3100所抑制。Kajiyama等［9］的研究顯示 CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸對(duì)卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移起非常重要的作用，而AMD3100則能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell小室及應(yīng)用Matrigel構(gòu)建與天然基底膜的結(jié)構(gòu)十分相似人工基底膜，具有侵襲能力的腫瘤細(xì)胞在下室的趨化因子誘導(dǎo)下穿過(guò)濾膜，模擬了腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)侵襲基底膜的過(guò)程來(lái)研究探討該學(xué)軸對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響。100 ng/ml的CXCL12因子是能促進(jìn)Tca8113細(xì)胞增殖的有效濃度［10］;本實(shí)驗(yàn)研究顯示一定濃度的 CXCL12因子對(duì)Tca8113細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，CXCL12因子刺激組，其穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)目多于對(duì)照組，同時(shí)應(yīng)用AMD3100預(yù)先干預(yù)組［10］，其穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)目少于空白對(duì)照組，說(shuō)明CXCL12因子對(duì)Tca8113細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用可以被CXCR4受體的拮抗劑所抑制，說(shuō)明CXCR12因子對(duì)Tca8113細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)效應(yīng)是通過(guò)CXCR4受體來(lái)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。由此我們認(rèn)為，淋巴結(jié)、肺組織等這些容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的器官，其可能高表達(dá)CXCR4受體，惡性腫瘤細(xì)胞在趨化因子的趨化牽引作用下，逆濃度梯度出現(xiàn)器官特異性轉(zhuǎn)移。關(guān)于Tca8113細(xì)胞的具體的器官特異性遷移機(jī)制還不甚明了，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。AMD3100作為CXCL12因子的特異性拮抗劑，其可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷CXCL12因子與CXCR4的結(jié)合，從而阻斷CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致了Tca8113細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的減弱。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中利用一定濃度的CXCL12因子及其抑制劑AMD3100，作用于體外培養(yǎng)的Tca8113細(xì)胞，證明了CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸在腫瘤細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移方面中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。關(guān)于CXCR4受體的抑制劑AMD3100，其阻斷CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸的具體機(jī)制，以及其作為一種新的有望成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，其作用機(jī)制及應(yīng)用前景還需要進(jìn)一步的研究和證實(shí)。

［1］ 邱蔚六，張震康，張志愿.口腔頜面外科學(xué)［M］.6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:230－231.

［2］ Wu X，Lee VC，Chevalier E，et al.Chemokine receptors as targets for cancer therapy［J］.Curr Pharm Des，2009，15(7):742－757.

［3］ Cheng Z，Zhou S，Wang X，et al.Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against human CXCR4:Cell proliferation and migration regulation for glioma cell line in vitro by CXCR4/SDF-1alpha signal［J］.Hybridoma(Larchmt)，2009，28(1):33－41.

［4］ Balkwill F.The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4［J］.Semin Cancer Biol，2004，14(3):171－179.

［5］ Muller A，Sonkoly E，Eulert C，et al.Chemokine receptors in head and neck cancer:Association with metastatic spread and regulation during chemotherapy［J］.Int J Cancer，2006，118(9):2147－2157.

［6］ Almofti A，uchida D，Begum NM，et al.The clinicopathological significance of the expression of CXCR4 protein in oral squamous cell carcinoma［J］.Int J Oncol，2004，25(1):65－71.

［7］ 李五一，徐萌，劉建國(guó)，等.趨化因子受體CXCR4在口腔頜面部惡性腫瘤中表達(dá)的研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2011，27(5):411－413.

［8］ 邱際華，劉求真，陳麗，等.CXCR4/SDF21對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖與遷移能力的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(7):598－600.

［9］ Lapteva N，Yang AG，Sanders DE，et al.CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo［J］.Cancer Gene Ther，2005，12(1):84 －89.

［10］ 劉紀(jì)雷，董國(guó)偉，韓新光.CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸對(duì)舌鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖行為的影響及AMD3100對(duì)其的干預(yù)［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2013，29(6):532－534，537.