廖德芳，苗海生，李 樂，寇美玲，高 林，李華春

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的，主要感染綿羊、牛和其他家養(yǎng)及野生反芻動(dòng)物的一種非接觸性蟲媒病毒病。BTV廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，至少有27種血清型，且型間無交叉保護(hù)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將BT列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[1-4]。在歐洲，BT已成為繼口蹄疫后最受關(guān)注的重要?jiǎng)游镆卟≈弧?005年至今，BT在歐洲及南亞地區(qū)大規(guī)模流行，疫情范圍波及比利時(shí)、荷蘭、德國、法國、盧森堡、英國、葡萄牙、希臘、奧地利和印度[5-6]，給這些國家?guī)砭薮蠼?jīng)濟(jì)損失。我國于1979年首次報(bào)道了BT疫情。2008年流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國31個(gè)省份存在BTV血清抗體陽性家畜，云南、湖北、重慶、山西、新疆、內(nèi)蒙古、廣西等地在自然感染羊中分離到了BTV[7]。

疫苗免疫接種是預(yù)防和控制BT的重要手段。BTV弱毒疫苗是最早使用的疫苗，但由于在減弱制備過程中存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，目前除南非外，其它地區(qū)已不再使用[8]。滅活疫苗是目前預(yù)防和控制BT的主要手段。2008年前后，歐洲國家在大范圍暴發(fā)BT疫情時(shí)，廣泛使用了滅活疫苗，使疫情得到了有效控制[9]。由于BTV有多個(gè)血清型，且型間不能交叉保護(hù)，本研究選擇致病性強(qiáng)的BTV-1型V863毒株制備滅活抗原，開展滅活疫苗免疫試驗(yàn)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)疫苗免疫效果。

1 材料與方法

1.1 疫苗毒株復(fù)壯與擴(kuò)增

疫苗毒株采用BTV-1型V863毒株，由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院保存。將毒株用單層生長至90%并且狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行復(fù)壯，用PBS清洗細(xì)胞1次，然后接種病毒，培養(yǎng)72～96 h；與對(duì)照相比，病變達(dá)80%時(shí)即可收獲；病毒滴度達(dá)到106TCID50/mL以上時(shí)，進(jìn)行大量擴(kuò)增。

1.2 病毒滅活、定量及疫苗制備

1.2.1 病毒滅活 每1 000 mL病毒懸液中加入

0.1 mol/L的BEI滅活劑3 mL，置37 ℃攪拌滅活；滅活20 h后換瓶，30 h后加入3 mL 1 mol/L的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，置4 ℃保存；取10 mL滅活病毒液，加入到長滿BHK-21細(xì)胞的800 mL培養(yǎng)方瓶?jī)?nèi)，另加入50 mL培養(yǎng)液，置37 ℃溫箱，每日觀察至第5日；對(duì)未發(fā)生病變的細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后繼續(xù)傳代觀察，如第3代仍未出現(xiàn)病變，則視為滅活徹底。

1.2.2 抗原定量 采用蔗糖密度梯度離心法純化BTV毒株，獲得標(biāo)準(zhǔn)抗原；利用BCA蛋白定量方法定量標(biāo)準(zhǔn)抗原。倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原后，利用ACELISA同時(shí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抗原和病毒滅活液，獲得標(biāo)準(zhǔn)抗原含量變化曲線；將病毒滅活液與該曲線對(duì)比，獲得病毒滅活液抗原含量。

1.2.3 抗原濃縮及乳化 每1 000 mL病毒液內(nèi)加入70 g PEG6000和22.2 g氯化鈉，4 ℃攪拌過夜，充分溶解；置Backman J2-M1轉(zhuǎn)頭離心瓶?jī)?nèi)，4 000 r/min離心60 min；每1 000 mL抗原液用10 mL MEM維持液重懸沉淀；將濃縮抗原，用MEM維持液分別稀釋為1、5、10、50和100 μg抗原含量；對(duì)1、5、10、50、100 μg/mL抗原含量的病毒液分別進(jìn)行乳化，最后加入2 mL Tween-80及1 mL 1%的硫柳汞，完成100 mL疫苗制備。

1.3 動(dòng)物免疫、攻毒和樣品采集

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 36只成年考摩型綿羊購自云南省種羊場(chǎng)。利用BTV cELISA方法、微量細(xì)胞中和試驗(yàn)確定試驗(yàn)羊?yàn)锽TV抗體陰性羊。隨機(jī)分為6組，每組6只。其中：1組為空白對(duì)照組，免疫乳化后的BHK-21細(xì)胞液；其他5個(gè)試驗(yàn)組分別免疫抗原含量為 1、5、10、50、100 μg/只份的疫苗。

1.3.2 免疫及樣品采集 疫苗免疫：待試驗(yàn)綿羊適應(yīng)新飼養(yǎng)環(huán)境后，采用皮下注射，進(jìn)行第1次免疫。試驗(yàn)組每只免疫2 mL疫苗，空白對(duì)照組免疫乳化后的BHK-21細(xì)胞液。首次免疫后第3周進(jìn)行第2次免疫，方法及用量同上。樣品采集：疫苗免疫0、1、2、3、4、5周后，分別用普通采血管和肝素鈉抗凝采血管，各采集血樣5～8 mL。

1.3.3 攻毒試驗(yàn)及樣品采集 首次免疫后5周，用同型BTV攻毒，每只綿羊皮下接種血毒1 mL。采用滴度為104.25CEID50的BTV-1肝素抗凝血（云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）攻毒，并分別于0、2、4、6、8、10、12、14 d采集EDTA抗凝血，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.4 微量血清中和試驗(yàn)

微量細(xì)胞中和試驗(yàn)方法，按世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）標(biāo)準(zhǔn)操作指南進(jìn)行。首先將血清于56 ℃水浴滅活30 min；在微量細(xì)胞培養(yǎng)板各孔內(nèi)，加入50 μL維持液，第1排再加25 μL維持液；將待檢血清加入第1排孔中，每孔25 μL，即第1排孔血清為1/4倍稀釋；混勻后，用移液器從第1排孔內(nèi)吸取50 μL移入第2排孔混勻，則第2排孔內(nèi)血清為1/8稀釋，依次稀釋，則第8排孔內(nèi)血清為1/512倍稀釋。將病毒稀釋成100 TCID50（50 μL），每孔加 50 μL 病毒稀釋液，并 設(shè) 立 100 TCID50、10 TCID50、1 TCID50的病毒和空白對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃ 5%CO2養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h；最后每孔加100 μL BKH-21細(xì)胞懸液，置37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中（CO2濃度為5%）培養(yǎng)48 h。當(dāng)對(duì)照成立時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果判定：被檢血清孔出現(xiàn)100%的細(xì)胞病變（CPE）時(shí)，判為陰性；50%以上出現(xiàn)保護(hù)，則為陽性。用Karber法計(jì)算血清中和抗體滴度。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

qRT-PCR檢測(cè)在ABI FAST 7500上進(jìn)行。采用一步法RT-PCR TAKARA RR064A試劑盒（大連寶生物），按照試劑盒說明書配制反應(yīng)液。采用20 μL體系，每個(gè)反應(yīng)加模版2 μL、引物0.4 μL、探針0.4 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95 ℃反應(yīng)10 s，45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)包括95 ℃ 5 s，60 ℃延伸34 s。引物和探針按SWISS ASSAY方法進(jìn)行[10]。引物和探針如下：

BTVF-MH：5'-TGGAAAAGCGATGTCAAA-3'

BTVR-MH：5'-ACATCATCACGAAACGCTTC-3'

BTVP-MH：

5'- FAM-ARGCTGCATTCGCATCGTACGC-BHQ1-3'

2 結(jié)果

2.1 抗原定量

經(jīng)抗原定量檢測(cè)，確定本批次抗原濃度為6.25 μg/mL。應(yīng)用PEG 6000濃縮后，分別制備1、5、10、50、100 μg/只份的5組滅活疫苗。

2.2 微量血清中和試驗(yàn)

應(yīng)用微量血清中和試驗(yàn)，對(duì)免疫后綿羊血清進(jìn)行BTV-1型中和抗體滴度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示（表1）：第1組（1 μg/只份）首次免疫后陽性率為33.3%，第2次免疫后陽性率為66.7%；第2組（5 μg/只份）首次免疫后陽性率為66.7%，第2次免疫后陽性率為100%；第3組（10 μg/只份）首次免疫后陽性率為83.3%，第2次免疫后陽性率為83.3%；第4組（50 μg/只份）首次免疫后陽性率為66.7%，第2次免疫后陽性率為66.7%；第5組（100 μg/只份）首次免疫后陽性率為33.3%，第2次免疫后陽性率為50.0%。其中，最高抗體滴度是第5組的13152號(hào)綿羊，抗體滴度達(dá)362。

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)

攻毒后第1～5免疫組的核酸陰性率分別為66.7%、83.3%、83.3%、50.0%、66.7%，總核酸陰性率為70.0%，對(duì)照組核酸陰性率為0。其中，5、10 μg/只份組的BTV核酸陰性率均為83.3%，保護(hù)效果最好（表2）。

2.4 中和抗體滴度與攻毒后病毒檢出率比較

以第5周攻毒時(shí)的中和抗體滴度為基準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示：免疫綿羊中，當(dāng)中和抗體滴度＜11時(shí)，攻毒后病毒陽性率為62.5%；當(dāng)中和抗體滴度≥64時(shí)，攻毒后病毒陽性率為0，即實(shí)現(xiàn)了完全保護(hù)；介于二者之間時(shí)，病毒陽性率為20.0%～25.0%（表3）。

表1 BTV中和抗體滴度檢測(cè)結(jié)果

表3 中和抗體滴度與攻毒后病毒檢出率比較

表2 疫苗免疫試驗(yàn)攻毒后qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前國際上預(yù)防和控制BT的主要手段是對(duì)易感動(dòng)物接種BTV滅活疫苗。我國目前對(duì)該病的重視程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，相關(guān)預(yù)防技術(shù)儲(chǔ)備缺失，一旦疫情暴發(fā)，將難以控制。

本研究采用BTV-1型 V863毒株制備的BTV-1型滅活油佐劑疫苗，能夠刺激綿羊機(jī)體產(chǎn)生BTV-1型中和抗體；應(yīng)用微量血清中和試驗(yàn)，對(duì)免疫后綿羊血清進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)接種1、5、10、50、100 μg/只份 BT滅活疫苗的綿羊，經(jīng)2次免疫后抗體陽性率分別為66.7%、100%、83.3%、66.7%、50.0%。其中，5 μg/只份組的BTV-1型中和抗體均呈陽性（滴度≥11判為陽性），100 μg/只份組內(nèi)最高血清中和抗體滴度高達(dá)362，免疫效果理想，達(dá)到應(yīng)用要求。由于國內(nèi)流行的BTV毒株一般不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)顯著臨床癥狀，因此在攻毒試驗(yàn)環(huán)節(jié)，除通過觀察綿羊是否出現(xiàn)臨床癥狀外，主要依據(jù)BTV在綿羊血液中能否擴(kuò)增來衡量疫苗保護(hù)效果[10]。中和抗體滴度與攻毒后病毒檢出率比較結(jié)果表明，只有中和抗體滴度≥64時(shí)，才可實(shí)現(xiàn)完全保護(hù)，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中要保證免疫動(dòng)物處于較高的免疫保護(hù)水平。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，第1～5組綿羊攻毒后的病毒陰性率分別為66.7%、83.3%、83.3%、50.0%、66.7%，即相應(yīng)比率綿羊獲得了保護(hù)，其中5 μg/只份組和10 μg/只份組BTV核酸陰性率均為83.3%，保護(hù)效果較好。

本試驗(yàn)使用綿羊數(shù)量偏少，綿羊個(gè)體差異可能會(huì)影響疫苗免疫效果，造成高抗原含量疫苗組反而比低抗原含量疫苗組免疫效果差，但不影響10 μg/只份的BTV滅活抗原含量可作為BTV滅活疫苗生產(chǎn)的推薦用量，這在BTV疫苗生產(chǎn)中具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)試驗(yàn)表明，BTV中和抗體滴度≥64時(shí)可以實(shí)現(xiàn)完全保護(hù)，可以此作為今后高效BTV滅活疫苗研究的依據(jù)。

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