胡曉雯,張沙沙,安 琳,AMBER Naz,朱洪新

(上海交通大學(xué)Bio-X研究院遺傳發(fā)育與精神神經(jīng)疾病教育部重點實驗室,上海200240)

肝臟脂肪變性指中性脂肪(主要是甘油三酯)在肝臟中積聚,通常是由肝細(xì)胞攝取血漿游離脂肪酸、肝臟脂肪酸合成與肝臟脂肪酸氧化、肝細(xì)胞分泌極低密度脂蛋白之間失衡導(dǎo)致.血漿中游離脂肪酸主要來自于食物攝取的脂肪分解及外周脂肪動員釋放的游離脂肪酸.在24 h饑餓條件下,肝臟脂肪酸合成受到抑制,但外周脂肪動員增強,脂肪組織大量甘油三酯水解產(chǎn)生的游離脂肪酸經(jīng)血液運輸至肝臟,肝臟攝取的游離脂肪酸一部分在線粒體中進行β氧化供能,另一部分重新合成甘油三酯以脂滴形式儲存,而有些甘油三脂可與膽固醇一起結(jié)合載脂蛋白,以極低密度脂蛋白的形式分泌到血液中.因此,血漿游離脂肪酸的增加導(dǎo)致肝臟攝取游離脂肪酸增多,肝臟新合成脂肪酸增多、肝臟脂肪酸氧化減少或肝細(xì)胞釋放極低密度脂蛋白障礙均可促進饑餓誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚[1].

自噬是在真核生物中經(jīng)溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)含物的分解代謝過程,其功能是能夠降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞器及糖原.近年的研究發(fā)現(xiàn),自噬可選擇性降解脂滴,其過程也稱為脂噬[2-4].在營養(yǎng)充足的條件下細(xì)胞以脂滴形式儲存過剩的脂質(zhì),這些脂質(zhì)主要含甘油三酯和膽固醇酯為主的中性脂肪.在饑餓誘導(dǎo)下,肝臟從血漿中攝取的大量游離脂肪酸中的部分形成脂滴,同時饑餓促進肝臟自噬活性.自噬通過溶酶體脂酶降解脂滴從而調(diào)控脂代謝,影響肝臟脂質(zhì)積聚.肝臟特異性敲除自噬相關(guān)基因Atg7促進饑餓誘導(dǎo)的小鼠肝臟甘油三脂和膽固醇的積聚,同時釋放到血液中,極低密度脂蛋白顯著減少[5].在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞,自噬阻斷導(dǎo)致脂滴數(shù)量和體積增大[5].

紫外線輻射耐受相關(guān)基因(ultraviolet resistance-associated gene,UVRAG)是一種自噬相關(guān)蛋白,具有多種生物學(xué)功能.UVRAG與自噬相關(guān)基因Beclin1的結(jié)合增強了Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶Vps34的活性,從而促進自噬體的生成和成熟[6-7].此外,UVRAG在抗凋亡[8]、維持染色體穩(wěn)定性[9]、調(diào)控內(nèi)吞[7]及自噬性溶酶體再生[10]等方面也起著重要作用.本研究前期工作發(fā)現(xiàn),UVRAG基因的缺失可導(dǎo)致小鼠自噬流阻斷[11],故對UVRAG在饑餓誘導(dǎo)肝臟脂肪變性中的作用進行了研究.

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠

本工作所用UVRAG基因缺失小鼠信息已發(fā)表,具體見文獻[11-12].本工作使用的實驗小鼠均為FVB/NJ遺傳背景的兩月齡雄性小鼠,在無特殊病原菌(specif i c-pathogen-free,SPF)級條件下飼養(yǎng),光照時間7:00—19:00,黑暗時間19:00—次日7:00.飼養(yǎng)環(huán)境維持恒溫、恒濕及恒壓.在正常條件下小鼠可自由攝取水和食物,且有充足的活動空間.所有動物實驗操作符合國際研究委員會指導(dǎo)準(zhǔn)則及上海市動物福利與保護委員會的要求,動物使用許可證號為[SYXK(SH)2011-0112].UVRAG基因缺失純合子小鼠通過UVRAG基因缺失的雜合子雄鼠與雌鼠交配獲得.在饑餓實驗中,饑餓組小鼠饑餓24 h,但可自由攝取水.對照組小鼠則可自由獲取食物和水.

1.2 試 劑

兔源性內(nèi)參基因GAPDH多克隆抗體(SanTa Cruz公司),兔源性Phospho-AMPKα多克隆抗體及兔源性AMPKα多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司),HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(麥約爾公司),油紅(Oil red O)(Sigma-Aldrich公司),Trizol(Life Technologies公司).

1.3 油紅染色

取肝臟組織,在最適切割溫度(optimal cutting temperature,OCT)包埋后制備8μm連續(xù)冰凍切片.冰凍切片在60%異丙醇溶液中浸泡1 min,與油紅染色液室溫孵育15 min后用蒸餾水清洗5次,然后用60%異丙醇清洗3 s,再用蒸餾水清洗3次.最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2 min.水溶性封片劑(VectorshieldTM)封片,在顯微鏡下觀察并拍片記錄.

1.4 組織總RNA提取及RT-PCR

取小鼠肝臟約20 mg,用Trizol提取組織總RNA.每個樣本取500 ng總RNA用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA.用Roche SYBR試劑盒進行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerize chain reaction,RT-PCR)分析,GAPDH作為內(nèi)參.RT-PCR基因引物序列見表1.

1.5 免疫印跡

取肝臟組織約20 mg,用含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的組織裂解液勻漿,收集含總蛋白的上清液.用NanoDrop分光光度計檢測蛋白濃度.組織蛋白用12.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜.5%脫脂奶粉封閉,與一抗在4°C孵育過夜,用磷酸鹽緩沖液(tris buあer solution tween,TBST)緩沖液洗膜后與二抗室溫孵育1 h,用TBST緩沖液洗膜后與顯影液孵育顯色.

1.6 血糖檢測

用小鼠眼球采血法獲得全血置于用肝素浸潤的1.5 mL離心管中,并在4°C條件下3 000 g離心5 min,取上清獲得血漿.用Accu-Chek Active(羅康全活力型)血糖儀(Roche公司)檢測血漿葡萄糖濃度.

1.7 血漿和肝臟中甘油三脂、總膽固醇和游離脂肪酸檢測

血漿及肝臟中的甘油三脂、總膽固醇和游離脂肪酸質(zhì)量比分別用Wako公司的LabAssayTMTriglyceride,LabAssayTMCholesterol及LabAssayTMNEFA試劑盒檢測.具體操作按試劑盒說明書進行.

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

平均數(shù)用mean±SEM(standard error of mean)表示,多組間平均數(shù)比較采用單因素方差分析,p＜0.05為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 UVRAG基因缺失促進饑餓誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性

在本研究前期工作中發(fā)現(xiàn),UVRAG基因缺失會導(dǎo)致自噬流阻斷[11].由于自噬在肝臟脂代謝中起著重要作用,因此推測UVRAG基因缺失會影響肝臟脂代謝.首先用油紅染色方法檢測UVRAG基因的缺失對饑餓誘導(dǎo)的小鼠肝臟中脂滴質(zhì)量比的影響.在正常生理條件下,UVRAG基因缺失小鼠和野生型對照的小鼠肝臟脂滴均很少,無明顯差異.在饑餓條件下,野生型小鼠肝臟脂滴顯著增加,但是UVRAG基因缺失小鼠脂滴較野生型小鼠進一步增加(見圖1(a),圖中Fed為正常喂養(yǎng)組,Fasted為饑餓處理組;+/+為野生型雄鼠,?/?為UVRAG基因缺失雄鼠;n=5,6;p＜0.05),表明UVRAG基因缺失能夠促進饑餓誘導(dǎo)的肝臟脂滴形成.接著本工作對肝臟組織甘油三脂、總膽固醇及游離脂肪酸進行檢測分析.在正常生理條件下,UVRAG基因缺失小鼠和野生型小鼠肝臟組織的甘油三脂無顯著差異.在饑餓條件下,野生型小鼠肝臟甘油三脂顯著上調(diào),而UVRAG基因缺失小鼠肝臟甘油三酯質(zhì)量比較野生型對照小鼠進一步增大,證實了UVRAG基因缺失促進小鼠肝臟組織脂質(zhì)積聚.類似地,在正常生理條件下,UVRAG基因缺失小鼠肝臟總膽固醇和游離脂肪酸質(zhì)量比與野生型小鼠對照無顯著性差異,但在饑餓條件下UVRAG基因缺失小鼠肝臟總膽固醇及游離脂肪酸質(zhì)量比較野生型對照顯著增大(見圖1(b)～(c)).這些結(jié)果表明,UVRAG基因缺失可促進饑餓誘導(dǎo)的肝臟組織脂質(zhì)積聚.

圖1 UVRAG基因缺失促進饑餓誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性Fig.1 UVRAG def i ciency exacerbates fasting-induced hepatic steatosis

2.2 UVRAG基因缺失對小鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的分析

肝臟脂質(zhì)積聚由游離脂肪酸的攝取、合成和氧化平衡失調(diào)所致.因此用實時RT-PCR的方法檢測脂代謝相關(guān)基因膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1)CD 36,FAS,PPARα,CPT-1及FGF 21的表達.其中CD 36是長鏈脂肪酸攝取的主要載體,SREBP 1是一種重要的脂質(zhì)生成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,FAS是脂肪酸生物合成中最重要的復(fù)合酶體,CPT-1是長鏈脂肪酸由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體氧化的關(guān)鍵限速酶,PPARα是調(diào)控脂代謝的核受體,FGF 21主要是肝臟中合成的調(diào)控脂代謝的細(xì)胞因子[13].結(jié)果顯示,在正常生理條件下UVRAG基因缺失小鼠和野生型小鼠肝臟組織CD 36,FAS,PPARα,CPT-1及FGF 21的表達無顯著性差異.UVRAG基因缺失小鼠肝臟組織SREBP-1表達較野生型小鼠顯著下調(diào).在饑餓條件下,UVRAG基因缺失小鼠和野生型小鼠肝臟組織CD 36表達無顯著變化.肝臟SREBP-1和FAS表達在饑餓條件下顯著下調(diào),與報道的結(jié)果一致[14],但UVRAG基因缺失小鼠和野生型小鼠無顯著變化.在饑餓條件下,野生型小鼠肝臟PPARα,CPT-1和FGF 21表達顯著上調(diào),與已報道的結(jié)果一致[14],但是UVRAG基因缺失小鼠和野生型小鼠無顯著變化(見圖2).圖2中,Fed為正常喂養(yǎng)組,Fasted為饑餓處理組;+/+為野生型雄鼠,?/?為UVRAG基因缺失純合子雄鼠;n=3;p＜0.05.以上結(jié)果表明,UVRAG基因缺失對肝臟脂質(zhì)攝取轉(zhuǎn)運、合成和氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達無影響.

圖2 UVRAG基因缺失對肝臟脂質(zhì)代謝和糖異生相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達的影響Fig.2 The inf l uence of UVRAG def i ciency to the expression levels of genes related to lipid metabolism and gluconeogenesis in the liver

2.3 UVRAG基因缺失對AMPK活性的作用

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)是細(xì)胞能量感受器,對肝臟脂代謝和糖代謝起著重要的調(diào)控作用[15].免疫印跡結(jié)果顯示,在饑餓條件下UVRAG基因缺失小鼠和野生型小鼠肝臟p-AMPK/AMPK無顯著變化(見圖3).圖3中,Fed為正常喂養(yǎng)組,Fasted為饑餓處理組;n=3;+/+為野生型小鼠,?/?為Rubicon基因缺失小鼠

2.4 UVRAG基因缺失對血漿參數(shù)的影響

由于在饑餓條件下,肝臟游離脂肪酸主要來自于白色脂肪組織動員釋放到血液中的脂肪酸,而UVRAG全身敲除可能會影響血液脂肪酸的濃度,從而對肝臟脂質(zhì)積聚產(chǎn)生影響,因此本工作檢測野生型小鼠和UVRAG基因缺失小鼠血漿中游離脂肪酸、甘油三脂和膽固醇濃度.結(jié)果顯示,在饑餓條件下UVRAG基因缺失小鼠血漿中甘油三脂和游離脂肪酸濃度較對照組顯著升高,而血漿膽固醇濃度無顯著性差異(見圖4(a)～(c)).饑餓后野生型小鼠血糖濃度較正常對照組顯著下調(diào),而UVRAG基因缺失純合子小鼠血糖濃度較野生型小鼠顯著降低(見圖4(d)).圖4中,Fed為正常喂養(yǎng)組,Fasted為饑餓處理組;+/+為野生型小鼠,?/?為UVRAG基因缺失小鼠;n=3,4,5;p＜0.05.這些結(jié)果表明,全身UVRAG基因缺失對血漿甘油三脂、游離脂肪酸及血糖產(chǎn)生影響.

表1 實時RT-PCR引物序列Table 1 Primers in real time RT-PCR

圖3 UVRAG基因缺失對AMPK活性的影響Fig.3 The inf l uence of UVRAG def i ciency to AMPK activation

圖4 UVARG基因缺失對血漿參數(shù)的影響Fig.4 The inf l uence of UVRAG def i ciency to blood prameters

3 討論

在正常生理條件下,UVRAG基因缺失不影響肝臟脂滴質(zhì)量比,這可能與脂滴形成較少及UVRAG基因缺失抑制但并沒有完全阻斷自噬有關(guān).在饑餓條件下,油紅染色及肝臟脂質(zhì)檢測分析顯示,UVRAG基因缺失促進肝臟脂質(zhì)變性,與預(yù)期結(jié)果一致.由于在饑餓條件下,肝臟攝取游離脂肪酸多于脂肪酸氧化,因此部分游離脂肪酸形成甘油三酯并以脂滴形式儲存,自噬通過水解脂滴提供游離脂肪酸.自噬抑制可導(dǎo)致脂滴分解減少,促進肝臟脂質(zhì)積聚.由于UVRAG基因缺失部分阻斷自噬,因此UVRAG基因缺失促進饑餓導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)積聚的部分原因是由于肝臟脂滴分解減少,從而加重肝臟脂質(zhì)積聚.

由于UVRAG基因缺失促進脂質(zhì)積聚,因此可能會影響肝臟脂代謝相關(guān)基因表達.本工作檢測了調(diào)控游離脂肪酸攝取基因CD 36,游離脂肪酸合成調(diào)控基因SREBP-1及FAS,游離脂肪酸氧化調(diào)控基因CPT-1,PPARα及FGF 21.意外的是,在饑餓條件下UVRAG基因缺失對上述基因表達無顯著影響.此外,在饑餓條件下UVRAG基因缺失小鼠肝臟脂代謝調(diào)控因子AMPK活性較野生型小鼠也沒有顯著變化.盡管目前原因不清楚,但本工作在檢測血漿參數(shù)時發(fā)現(xiàn),在饑餓條件下UVRAG基因缺失小鼠血漿游離脂肪酸較野生型小鼠顯著上調(diào).因此可推測,在饑餓條件下雖然UVRAG基因缺失可能會導(dǎo)致肝臟脂滴降解所提供的脂肪酸減少,但是肝臟可能從血漿中攝取游離脂肪酸增多,因此肝臟脂質(zhì)氧化及脂肪酸合成相關(guān)基因表達沒有發(fā)生顯著變化.此外,本工作還檢測了血糖濃度.在饑餓條件下,野生型小鼠血糖顯著下降,與預(yù)期一致.UVRAG基因缺失小鼠血糖濃度較野生型小鼠進一步下調(diào),這可能與UVRAG基因缺失導(dǎo)致自噬抑制有關(guān).近期的報道顯示,在饑餓條件下自噬在血糖濃度維持中起著重要作用[16].

目前,尚不清楚UVRAG基因缺失小鼠血漿游離脂肪酸上調(diào)的機制,但本工作的前期研究結(jié)果和其他報道表明,UVRAG基因缺失或下調(diào)抑制自噬體成熟從而導(dǎo)致自噬流阻斷,伴有自噬體增多[7,11].最近有研究表明,將自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ可與甘油三酯脂酶(adipose triacylglyceride lipase,ATGL)結(jié)合可促進脂滴降解[17].在饑餓條件下,血漿游離脂肪酸主要來自于白色脂肪動員,因此很有可能是UVRAG基因缺失導(dǎo)致白色脂肪中自噬體增多,LC3Ⅱ與脂滴表面結(jié)合增加,從而募集更多ATGL促進脂肪動員,這還有待進一步證實.

綜上所述,在本工作中可發(fā)現(xiàn)UVRAG基因缺失促進饑餓誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性,這可能由肝臟脂噬減少及肝臟對血漿游離脂肪酸攝取增多導(dǎo)致.進一步研究揭示UVRAG在病理性脂肪肝發(fā)生中的作用將有重要的實踐意義,從而為病理性脂肪肝的預(yù)防和治療提供新的靶點.

致謝 感謝復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所提供了UVRAG基因缺失小鼠.

[1]KAWANO Y,COHEN D E.Mechanisms of hepatic triglyceride accumulation in non-alcoholic fatty liver disease[J].Journal of Gastroenterology,2013,48(4):434-441.

[2]LIU K,CZAjA M J.Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy[J].Cell Death and Diあerentiation,2013,20(1):3-11.

[3]SINGH R,KAUSHIK S,WANG Y J,et al.Autophagy regulates lipid metabolism[J].Nature,2009,458:1131-1135.

[4]CARMONA-GUTIERREZ D,ZIMMERMANN A,MADEO F.A molecular mechanism for lipophagy regulation in the liver[J].Hepatology,2015,61(6):1781-1783.

[5]MARTINEZ-LOPEZ N,SINGH R.Autophagy and lipid droplets in the liver[J].Annual Review of Nutrition,2015,35:215-237.

[6]LIANG C,FENG P,KU B,et al.Autophagic and tumour suppressor activity of a novel Beclin1-binding protein UVRAG[J].Nature Cell Biology,2006,8(7):688-699.

[7]LIANG C,LEE J S,INN K S,et al.Beclin1-binding UVRAG targets the class C Vps complex to coordinate autophagosome maturation and endocytic traきcking[J].Nature Cell Biology,2008,10(7):776-787.

[8]YIN X C,CAO L Z,KANG R,et al.UV irradiation resistance-associated gene suppresses apoptosis by interfering with BAX activation[J].EMBO Reports,2011,12(7):727-734.

[9]ZHAO Z,OH S,LI D,et al.A dual role for UVRAG in maintaining chromosomal stability independent of autophagy[J].Developmental Cell,2012,22(5):1001-1016.

[10]MUNSON M J,ALLEN G F,TOTH R,et al.mTOR activates the VPS34-UVRAG complex to regulate autolysosomal tubulation and cell survival[J].The EMBO Journal,2015,34(17):2272-2290.

[11]SONG Z,AN L,YE Y,et al.Essential role for UVRAG in autophagy and maintenance of cardiac function[J].Cardiovascular Research,2014,101(1):48-56.

[12]DING S,WU X,LI G,et al.Eきcient transposition of the piggyBac(PB)transposon in mammalian cells and mice[J].Cell,2005,122(3):473-483.

[13]VACCA M,ALLISON M,GRIFFIN J L,et al.Fatty acid and glucose sensors in hepatic lipid metabolism:implications in NAFLD[J].Seminars in Liver Disease,2015,35(3):250-261.

[14]PALOU M,PRIEGO T,S′ACHEZ J,et al.Sequential changes in the expression of genes involved in lipid metabolism in adipose tissue and liver in response to fasting[J].Pf l ugers Arch,2008,456(5):825-836.

[15]VIOLLET B,GUIGAS B,LECLERC J,et al.AMP-activated protein kinase in the regulation of hepatic energy metabolism:from physiology to therapeutic perspectives[J].Acta Physiol(Oxf),2009,196(1):81-98.

[16]EZAKI J,MATSUMOTO N,TAKEDA-EZAKI M,et al.Liver autophagy contributes to the maintenance of blood glucose and amino acid levels[J].Autophagy,2011,7(7):727-736.

[17]MARTINEZ-LOPEZ N,GARCIA-MACIA M,SAHU S,et al.Autophagy in the CNS and periphery coordinate lipophagy and lipolysis in the brown adipose tissue and liver[J].Cell Metabolism,2016,23(1):113-127.