穆峰 鄭修廣 劉圣恒 陳光偉 張作文 李紅梅 張運(yùn)宏 牟曉洋

(重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科；2.檢驗(yàn)科；3.神經(jīng)外科，重慶 402260)

腦出血是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病﹑多發(fā)病，其致殘率和死亡率居高不下。而且存活的患者中，會(huì)有較多患者遺留永久殘疾，如偏癱。本課題擬通過(guò)外源性NGF聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練作用于腦出血大鼠，觀察并了解NGF聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練在腦出血致偏癱大鼠促其功能恢復(fù)的作用及其機(jī)制，為NGF聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練在腦出血患者中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論基礎(chǔ)，開(kāi)拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組 健康清潔級(jí)成年雄性SD大白鼠96只，體重(280±50)g(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、康復(fù)訓(xùn)練組、NGF治療組(腹腔內(nèi)注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子30ug/kg)和康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合NGF治療共四組，每組各24只。每組下設(shè)3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，分別為造模成功后第1﹑2﹑3周和每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。

1.2 方法 康復(fù)訓(xùn)練組：造模成功后，進(jìn)行平衡、 旋轉(zhuǎn)、抓握訓(xùn)練。NGF組：每天腹腔內(nèi)注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子30ug/kg。NGF聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練組：按照康復(fù)訓(xùn)練組和NGF組方法進(jìn)行。對(duì)照組：不予任何處理。

1.2.1 腦出血大鼠模型的制備 采用膠原酶誘導(dǎo)法建立大鼠腦出血?jiǎng)游锬Ｐ蚚1]，具體步驟如下：大鼠術(shù)前12h禁食，4h禁水，用0.4%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔麻醉。保證手術(shù)操作期間大鼠有自主呼吸，俯臥固定于江灣型動(dòng)物頭顱立體定位儀上。將大鼠頭皮丁字形切開(kāi)，取前囟為原點(diǎn)，向右3mm，向后1mm，深度5mm為進(jìn)針點(diǎn)。骨鉆鉆開(kāi)顱骨，進(jìn)針后緩慢注入含0.5U膠原酶的生理鹽水2uL，留針2min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚。術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5～37.50C ，手術(shù)后大鼠被送到通風(fēng)和有空調(diào)的動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2.2 模型成功評(píng)價(jià) 根據(jù)Berderson等[2]的評(píng)定方法分為四級(jí)。0級(jí)：沒(méi)有神經(jīng)功能缺失癥狀；1級(jí)：將大鼠尾巴提起時(shí)，可見(jiàn)癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；2級(jí)：除1級(jí)體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；3級(jí)：除1級(jí)、2級(jí)體征外，大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大部分2h內(nèi)蘇醒。注入膠原酶后2h以后對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀進(jìn)行評(píng)定，如果神經(jīng)功能缺損癥狀達(dá)1、2、3級(jí)判斷為造模成功，否則排除進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 康復(fù)訓(xùn)練方法 康復(fù)訓(xùn)練組及NGF聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練組于造模后休息2d，從第3d起開(kāi)始采用自制儀器進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練:①平衡木訓(xùn)練采用170cm長(zhǎng)、2cm寬的方木棒，平放在距地面7cm處，作為一個(gè)平衡木讓大鼠在上面行走，用于評(píng)估及訓(xùn)練大鼠的平衡功能。②轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練采用長(zhǎng)150cm、直徑4.5cm的木棒1根，其中點(diǎn)固定在3r/min的轉(zhuǎn)動(dòng)器上，分別向左右交替轉(zhuǎn)動(dòng)，用于評(píng)估及訓(xùn)練大鼠的動(dòng)態(tài)平衡功能。③網(wǎng)屏訓(xùn)練，網(wǎng)屏為50cm*40cm網(wǎng)帶，1cm*1cm網(wǎng)眼，網(wǎng)板的左右和上方都用25cm高的木板框邊，網(wǎng)屏距地面高度為80cm，下方鋪以12cm厚的海綿。先將網(wǎng)屏水平放置，將老鼠放在上面，然后緩緩地將其一端抬高，在2s內(nèi)將此網(wǎng)屏變成垂直位，保持5s，觀察大鼠是否會(huì)從網(wǎng)屏上掉下來(lái)或用前爪抓握住網(wǎng)屏，用于評(píng)價(jià)大鼠前爪抓握能力及肌力情況。以上訓(xùn)練每天共計(jì)30min，每周康復(fù)訓(xùn)練5d。

1.2.4 行為評(píng)估

1.2.4.1 神經(jīng)功能障礙評(píng)分 按Garcia[3]等方進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分，最高分18分，最低分3分，分?jǐn)?shù)越低，神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.2.4.2 平衡木行走評(píng)分 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為6個(gè)等級(jí)。0分為大鼠能跳上平衡木，在上面行走時(shí)不會(huì)跌倒；1分為大鼠 能跳上平衡木，在上面行走時(shí)，跌倒概率低于50%；2分為大鼠能跳上平衡木，在上面行走時(shí),跌倒概率高于50%；3分為大鼠在健側(cè)后肢輔助下能跳上平衡木，但受累的癱側(cè)后肢不能輔助向前移動(dòng)；4分為大鼠在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分為大鼠放在平衡木上會(huì)馬上掉下來(lái)。

1.2.4.3 轉(zhuǎn)棒行走評(píng)分 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為4個(gè)等級(jí)。0分為在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中，大鼠可在轉(zhuǎn)棒上行走；1分為在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中，60s以上時(shí)間，大鼠不會(huì)從轉(zhuǎn)棒上掉下來(lái)；2分為轉(zhuǎn)動(dòng)開(kāi)始后，大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉下來(lái)；3分為轉(zhuǎn)動(dòng)開(kāi)始前，大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉下來(lái)。

1.2.4.4 網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為4個(gè)等級(jí)。0分為大鼠前爪握住網(wǎng)屏超過(guò)5s，不會(huì)掉下來(lái)；1分為大鼠可暫時(shí)握住網(wǎng)屏，滑落一段距離，但不會(huì)掉下來(lái)：2分為大鼠在5s內(nèi)掉下來(lái)；3分為網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，大鼠立刻掉下來(lái)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠術(shù)后2小時(shí)模型成功評(píng)價(jià) 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有12只大鼠死亡，另有17只大鼠手術(shù)后模型評(píng)價(jià)為0級(jí)，被剔除實(shí)驗(yàn)，用備用大鼠進(jìn)行隨機(jī)補(bǔ)充。最后模型成功評(píng)價(jià)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠術(shù)后2小時(shí)模型成功評(píng)價(jià) Table 1 The evaluation of the model 2 hours after operation

注：0級(jí)為剔除的大鼠，未進(jìn)入實(shí)驗(yàn)

2.2 各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能障礙評(píng)分 康復(fù)組及NGF組各觀察時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能障礙評(píng)分均高于對(duì)照組 (P<0.05)，且NGF+康復(fù)組各觀察時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能障礙評(píng)分均高于康復(fù)組及NGF組(P<0.05)。提示不管是康復(fù)訓(xùn)練還是NGF治療均能改善ICH大鼠神經(jīng)功能障礙，并且康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合NGF治療對(duì)ICH大鼠神經(jīng)功能障礙改善具有協(xié)同作用，見(jiàn)表2。

表2 各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能障礙評(píng)分 Table 2 Neurological dysfunction score

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05;與康復(fù)組比較，②P<0.05;與NGF組比較，③P<0.05

2.3 各組大鼠平衡木行走評(píng)分 各組大鼠不同觀察時(shí)間點(diǎn)平衡術(shù)行走評(píng)分，康復(fù)組及NGF組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NGF+康復(fù)組與康復(fù)組及NGF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)平衡木行走評(píng)分 Table 3 Balance wood walking score

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05;與康復(fù)組比較，②P<0.05;與NGF組相比，③P<0.05

2.4 各組大鼠轉(zhuǎn)棒行走評(píng)分 各組大鼠不同觀察時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)棒行走評(píng)分，康復(fù)組及NGF組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NGF+康復(fù)組與康復(fù)組及NGF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)棒行走評(píng)分 Table 4 Stick walk score

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05;與康復(fù)組比較，②P<0.05;與NGF組相比，③P<0.05

2.5 各組大鼠網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分 各組大鼠不同觀察時(shí)間點(diǎn)網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分，康復(fù)組及NGF組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NGF+康復(fù)組與康復(fù)組及NGF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分 Table 5 Screen test score

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05;與康復(fù)組比較，②P<0.05;與NGF組相比，③P<0.05

3 討論

3.1 康復(fù)訓(xùn)練與出血性腦損傷 康復(fù)訓(xùn)練是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)最有效的刺激方式之一，所有運(yùn)動(dòng)都可向中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供各種反射性傳入，運(yùn)動(dòng)對(duì)大腦的功能重建和代償起著至關(guān)重要的作用。康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦可塑性的影響與訓(xùn)練的方式密切相關(guān)；并且與腦損傷后開(kāi)始康復(fù)訓(xùn)練的時(shí)間，以及運(yùn)動(dòng)量的大小密切相關(guān)[4]。出血性腦損傷后早期進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練能夠加快腦組織側(cè)支循環(huán)的建立，改善病灶區(qū)的血液供應(yīng)，重塑腦功能。同時(shí)康復(fù)訓(xùn)練有利于建立側(cè)支循環(huán)式神經(jīng)軸突突觸間的聯(lián)系，和對(duì)側(cè)大腦半球功能代償及重組。通過(guò)反復(fù)的任務(wù)式特定訓(xùn)練，促使?jié)撛诘纳窠?jīng)通路和突觸啟動(dòng)，形成大腦反應(yīng)突觸，在此基礎(chǔ)上神經(jīng)周?chē)M織在突觸的作用下形成側(cè)支，使病灶處神經(jīng)功能獲得重建[5-7]。康復(fù)訓(xùn)練的主要作用有[8]: ①它能加強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的緊張度，防止因長(zhǎng)期臥床引起的全身生理機(jī)能退化。②它能改善偏癱肢體的血液循環(huán)，加強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能，從而預(yù)防或減輕肌肉、骨骼的廢用性萎縮。③它可使大腦處于休眠狀態(tài)的突觸活化，促進(jìn)突觸發(fā)芽、再生，使得大腦的功能重組。因此，早期系統(tǒng)的康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦出血后偏癱患者肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有顯著促進(jìn)作用，使患者的日常生活能力得到改善，從而提高患者的生存質(zhì)量，降低致殘率，減輕家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)[9]。

3.2 NGF治療腦出血的作用機(jī)制 NGF是一種影響神經(jīng)細(xì)胞存活及發(fā)育的多功能神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子, 它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、正常功能的維持及損傷修復(fù)中起著十分重要的作用[10]。一方面，NGF能夠在機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)基底前的腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)育、分化；另一方面，在出血性腦損傷的自我保護(hù)與修復(fù)中NGF也起著重要作用。 在出血性腦損傷中它主要通過(guò)以下幾個(gè)方面促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。①為神經(jīng)功能的修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)因子。NGF可以為損傷的神經(jīng)元提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持，加強(qiáng)正常神經(jīng)活動(dòng)所需要分子的表達(dá)，從而加快神經(jīng)功能的修復(fù)[11]。Liu等[12]通過(guò)觀察幼齡、老齡大鼠腦內(nèi)NGF水平,膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶( ChAT) 活性及相應(yīng)的空間學(xué)習(xí)能力之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)3者同步發(fā)生年齡依賴(lài)性的變化。如在老齡大鼠側(cè)腦室內(nèi)注入NGF，能顯著提高基底前腦膽堿能神經(jīng)元內(nèi)ChAT的活性,并促使其神經(jīng)元體積增大。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,空間定位能力也明顯提升。②作用于神經(jīng)干細(xì)胞。NGF可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化并能夠促進(jìn)其發(fā)育成熟，并為誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持作用。出血性腦損傷后NGF可促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖，保護(hù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，誘導(dǎo)軸突發(fā)育,從而使受損的神經(jīng)功能得到修復(fù)[13]。烏優(yōu)圖[14]等在觀察NSCs向神經(jīng)元分化過(guò)程中神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)軸突生長(zhǎng)的作用，結(jié)果顯示誘導(dǎo)組單個(gè)神經(jīng)元的平均軸突數(shù)量和最長(zhǎng)軸突平均長(zhǎng)度均大于對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)研究證明NGF可以促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化，且對(duì)神經(jīng)突起形成和生長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用。③對(duì)抗自由基。腦出血后，患者存在嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，NGF可以增加超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等自由基清除劑的活性，從而減輕神經(jīng)元損傷[15]。 NGF可以通過(guò)增加過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等自由基清除劑的活性,減輕神經(jīng)元損傷[16]。④抑制出血性腦損傷后的神經(jīng)元凋亡。劉懷軍[17]等研究報(bào)道用犬腦內(nèi)注入非肝素化的自體動(dòng)脈血建立ICH動(dòng)物模型，結(jié)果證實(shí)ICH早期血腫周邊組織中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞占37%。在出血性腦損傷中NGF通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡的過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)的作用，尤其是在出血性腦損傷后引起的遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要的作用[18]。⑤促進(jìn)新生血管的形成。腦出血的損傷部位存在血管破壞、出血及局部缺血，NGF對(duì)血管再生有一定的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)NGF不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)間接地促進(jìn)新生血管形成，NGF還具有直接促進(jìn)新生血管形成的作用[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，康復(fù)訓(xùn)練有利于建立側(cè)支循環(huán)式神經(jīng)軸突突觸間的聯(lián)系，促使?jié)撛谏窠?jīng)通路和突觸啟動(dòng)，形成大腦反應(yīng)突觸。而神經(jīng)生長(zhǎng)因子則可以對(duì)抗自由基，減少神經(jīng)元凋亡，以及促進(jìn)血管新生等在出血性腦損傷的自我保護(hù)與修復(fù)中發(fā)揮重要作用。所以康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療腦出血大鼠時(shí)具有協(xié)同作用。在實(shí)際的臨床工作中腦出血患者的神經(jīng)功能重建是一項(xiàng)復(fù)雜而艱巨的工作，然而當(dāng)前我國(guó)部分醫(yī)院還是按藥物治療為主體的治療模式，不重視康復(fù)訓(xùn)練治療，導(dǎo)致腦出血患者致殘率高，生活質(zhì)量降低。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，神經(jīng)康復(fù)訓(xùn)練是降低腦出血患者致殘率的有效方法之一，臨床醫(yī)師應(yīng)加強(qiáng)與神經(jīng)康復(fù)醫(yī)師合作，建立起包括藥物治療、肢體功能康復(fù)、心理輔導(dǎo)等在內(nèi)的卒中病房。使患者在接受臨床藥物治療的同時(shí)，能盡早接受康復(fù)指導(dǎo)和訓(xùn)練，減少后遺癥，提高生活質(zhì)量。

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