周子明，謝彩玲，趙 斌，2*，郭 狄

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)藥系，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)中心中山分中心，廣東 中山 528436；3.中山鼎晟質(zhì)檢服務(wù)有限公司，廣東 中山 528400)

黃曲霉毒素B1(AFB1)是由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一種次生代謝物，進入人體或動物體內(nèi)后，會導(dǎo)致急、慢性中毒，甚至發(fā)生癌變或畸變[1-4]。近年來,各種食品、藥品中AFB1超標(biāo)現(xiàn)象頻現(xiàn)，對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，檢測食物、藥物等中AFB1的含量非常重要。

目前，檢測AFB1的常用方法有薄層色譜法[5]、氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9]。但上述方法存在檢測儀器昂貴、操作不便、檢測時間長等不足，亟需建立一種快速、簡便的檢測AFB1的新方法。

側(cè)向?qū)游龇ㄊ抢^酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)后發(fā)展起來的即時檢測技術(shù)(Point of care test,POCT)[10-11]。自Beggs等[12]將免疫層析技術(shù)成功用于人絨毛膜促性腺激素(HCG)的測定后，膠體金免疫層析技術(shù)逐漸發(fā)展成為國際臨床研究應(yīng)用最廣泛的快速診斷技術(shù)之一[13-15]。隨著技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的膠體金定性檢測技術(shù)已不能滿足臨床診斷需要，提高免疫層析技術(shù)的精確度和靈敏度勢在必行，利用微米級的熒光微球(Fluorescent microsphere,FM)進行半定量或定量免疫層析技術(shù)已成為新的發(fā)展方向。熒光微球具有粒徑均勻、表面光滑、單分散性好、熒光強度高、容易修飾等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全等領(lǐng)域[16-18]。

適配體(Aptamer)是一類單鏈DNA或RNA序列，通過配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選得到。由于Aptamer具有特異性高、熱穩(wěn)定性好、易于合成修飾以及靶物質(zhì)廣泛的特點，已被用于多種生物傳感器的構(gòu)建[19-23]。AFB1的特異性適配體自2012年被加拿大的Neoventures Biotechnology Inc公司首次報道后，基于適配體構(gòu)建的AFB1檢測方法日益引起關(guān)注[24-26]。

本文基于側(cè)向?qū)游龇ǖ脑順?gòu)建了一種熒光定量檢測黃曲霉毒素B1的試紙條。該試紙條的結(jié)合墊上包被熒光微球標(biāo)記的DNA分子發(fā)夾探針，該DNA分子發(fā)夾的“環(huán)”(DNA分子發(fā)夾由環(huán)和莖組成)由黃曲霉毒素B1的適配體構(gòu)成，而檢測線處則包被一段堿基序列，該段序列與DNA分子發(fā)夾莖的序列互補。通過此設(shè)計策略，檢測線處熒光的強度與待測樣品中AFB1的含量呈線性關(guān)系。利用這一原理，通過一個“off-on”的熒光信號，實現(xiàn)對待測樣品中AFB1的高靈敏檢測。結(jié)果表明，該方法具有高靈敏、高特異性的優(yōu)點，能用于實際樣品中AFB1含量的分析，具有較為重要的實際應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

黃曲霉毒素B1購自Sigma公司(上海)，帶羧基的熒光微球(激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長620 nm)購自上海輝質(zhì)有限公司；Roche牛血清白蛋白(組份五)購自深圳天深醫(yī)療器械有限公司；Tris、吐溫20、葡聚糖、海藻糖均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司(上海);1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，98.5%)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)、鏈霉親和素均購自阿拉丁試劑(上海) 股份有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜)購自 Millipore(MA,USA)；ProClin300購自Supelco公司(美國)；玻璃纖維素墊、吸水紙、PVC底板、均購自通成紙制品有限公司。試紙條卡殼購自青島廣達森塑膠有限公司。涼茶、生脈飲、急支糖漿樣品為國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)中心中山分中心自行研制。DNA片段購自生工生物工程(上海) 股份有限公司，堿基序列見表1，均稀釋成100 μmol/L后待用。其他所用試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司(上海)。實驗所用超純水(≥18.2 MΩ·cm)由Millipore公司的Milli-Q system(美國) 凈化制得。

表1 DNA片段的堿基序列Table 1 Alignment of DNA oligonucleotide sequences

1.2 儀器設(shè)備

真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀(Eppendorf，德國)，超聲波清洗器(KQ5200，昆山市超聲儀器有限公司)，電子防潮柜(杭州智碩電子科技有限公司)，真空鼓風(fēng)干燥箱(上海姚氏儀器設(shè)備廠)，熒光測試儀FA50(深圳錦瑞生物科技股份有限公司)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)，噴金劃膜儀、斬切機和壓殼機(杭州峰杭科技有限公司)。

1.3 標(biāo)記探針的制備

熒光微球標(biāo)記DNA分子發(fā)夾參照碳化二亞胺法[20]制備，具體步驟如下：1 mg熒光微球加至50 mmol/L pH 6.0的MES緩沖液中，充分混勻后，于14 000 r/min離心15 min后，去除上清液，再加入1 mL MES緩沖液重懸微球，離心，重復(fù)3次后，最終用1 mL pH 7.4的PBS緩沖液重懸微球。加入20 μL 5 mg/mL的EDC和20 μL 1.5 mg/mL的NHS后，室溫下攪拌反應(yīng)0.5 h。向上述混合溶液中加入DNA分子發(fā)夾(50 μL,100 μmol/L)溶液，渦旋混勻后，反應(yīng)2 h。所得混合物用PBS緩沖液離心清洗3次，棄去上清液后，用PBS緩沖液重懸得到標(biāo)記探針母液，待用。

1.4 檢測探針與質(zhì)控探針的制備

取過量鏈霉親和素與50 μL 100 μmol/L的Sequence 2在常溫下振蕩反應(yīng)0.5 h。待鏈霉親和素-Sequence 2形成檢測探針后，用噴金劃膜儀將其噴涂在硝酸纖維素上。

取過量鏈霉親和素與50 μL 100 μmol/L的Sequence 3在常溫下振蕩反應(yīng)0.5 h。待鏈霉親和素-Sequence 3形成質(zhì)控探針后，用噴金劃膜儀將其噴涂在硝酸纖維素上。

1.5 AFB1試紙條的組裝

AFB1試紙條主要由樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙、PVC底板以及塑料外殼組成(如圖1A)。標(biāo)記探針吸附在玻璃纖維膜上；檢測探針和質(zhì)控探針均包被在硝酸纖維膜上。各部分重疊約2 mm。裁成約4 mm的寬度后，裝在塑料卡殼內(nèi)備用。組裝好的試紙條NC膜上有2條線，靠近吸水紙一端為質(zhì)控線(C)，靠近結(jié)合墊一端為檢測線(T)。用熒光分析儀進行檢測時，只有C線有熒光峰時，才表明該試紙條有效；否則無效。

1.6 AFB1的檢測

取待測樣本100 μL，從試紙條的樣品滴加處加樣，10 min后，將滴加待測樣本的試紙條放入熒光測試儀進行檢測。當(dāng)待測樣本中不含AFB1時，檢測區(qū)不會出現(xiàn)亮線，質(zhì)控區(qū)會出現(xiàn)亮線；當(dāng)待測樣本中含有AFB1，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)亮線。

1.7 實際樣品中AFB1含量的檢測

取涼茶、生脈飲、急支糖漿3個不同品種的樣品各1 mL，分別加入9 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，將3個樣本分別分成3份，涼茶3個樣本編號為1、2、3；生脈飲3個樣本編號為4、5、6；急支糖漿3個樣本編號為7、8、9。將9個樣本依次通過上述制作的AFB1試紙條進行檢測，每個樣本重復(fù)3次。同時用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)方法進行測定，作為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于側(cè)向?qū)游龇z測黃曲霉毒素B1的方法學(xué)原理

AFB1試紙條檢測原理如圖1所示。當(dāng)待測樣本中不含AFB1時(見圖1B)，標(biāo)記物結(jié)合墊處的標(biāo)記探針隨著層析方向向右移動，由于標(biāo)記探針中的DNA分子發(fā)夾“莖”處雙鏈的存在，故不會與反應(yīng)膜上檢測區(qū)的Sequence 2互補結(jié)合，因此在檢測區(qū)未檢出熒光峰(T)。當(dāng)標(biāo)記探針層析到質(zhì)控區(qū)，標(biāo)記探針中的AFB1適配體則會與質(zhì)控區(qū)的Sequence 3互補結(jié)合，因此在質(zhì)控區(qū)檢出熒光峰(C)；當(dāng)待測樣本中含有AFB1時(見圖1C)，AFB1先與標(biāo)記物結(jié)合墊處標(biāo)記探針中的AFB1適配體結(jié)合，同時，標(biāo)記探針中DNA分子發(fā)夾的雙鏈部分被打開，AFB1與標(biāo)記探針形成的復(fù)合物層析到反應(yīng)膜的檢測區(qū)時，與檢測區(qū)的Sequence 2互補結(jié)合，導(dǎo)致標(biāo)記探針形成的復(fù)合物在檢測區(qū)被捕獲，使得檢測區(qū)檢出熒光峰。而過量未反應(yīng)的標(biāo)記探針層析到質(zhì)控區(qū)處，被質(zhì)控區(qū)的Sequence 3捕獲，使得質(zhì)控區(qū)也檢出熒光峰。根據(jù)檢測區(qū)熒光峰強度(T)和質(zhì)控區(qū)熒光峰強度(C)的比值，即T/C值，可實現(xiàn)對AFB1的檢測。待測樣本中AFB1的含量越高，試紙條標(biāo)記物結(jié)合墊處的標(biāo)記探針量越多，檢測區(qū)的熒光信號T值越大，對應(yīng)的熒光信號的T/C值也越大。

圖1 基于側(cè)向?qū)游龇z測黃曲霉毒素B1的方法學(xué)原理Fig.1 Schematic depiction of the lateral flow assay to detect AFB1A：structure of the AFB1 strip；schematic depiction for detection in the absence(B) and presence(C) of AFB1

圖2 AFB1試紙條對AFB1的檢測Fig.2 Detection of AFB1 based on lateral flow assaya：the strip was assembled without the test probe,the control probe and labeled probe;b：with the test probe and the control probe and without the labeled probe;c：with the test probe,the control probe and just FMs;d：with the test probe,the control probe and the labeled probe.1∶5 diluent of the labeled probe stoste was coated on the conjugate pad；concentration of the test probes and the control probe were 1 μmol/L,and 10 ng/mL for the sample，each experiment had been done for three times

圖3 不同方法學(xué)的AFB1試紙條對AFB1的檢測結(jié)果Fig.3 Detection of AFB1 based on different methods by lateral flow assay the results were without(A),with(B) AFB1 by the strip assembled by antigen & antibody-dependent colloidal gold immunochromatography;the results were without(C),with(D) AFB1 by the strip assembled by aptamer-dependent colloidal gold immunochromatography;the results were without(E),with(F) AFB1 by the strip assembled by this method;concentration of AFB1 was 5 μg/L,each experiment had been done for three times

圖4 不同濃度AFB1的熒光峰變化圖Fig.4 Fluorescence diagram for the fluorescence intensity of the test line and the control line with different concentrations of AFB1 concentration of AFB1(a-h) ：0,0.1,0.5,2,5,10,50 μg/L；the insert showed the amplifying diagram of the fluorescence peaks at the test line of curve a and b;concentration of the test probe and the control probe were 1 μmol/L,0.5 mg/mL for the labeled probe;each experiment had been done for three times

基于該原理，對此方法進行了驗證，如圖2所示。當(dāng)NC膜上未包被檢測探針和質(zhì)控探針，結(jié)合墊上也未噴涂標(biāo)記探針時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)均未檢出熒光峰(曲線a)。當(dāng)NC膜上包被檢測探針和質(zhì)控探針，結(jié)合墊上不噴涂標(biāo)記探針時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)依然未檢出熒光峰(曲線b)。當(dāng)NC膜上包被檢測探針和質(zhì)控探針，僅將熒光微球噴涂在結(jié)合墊上時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)依然未檢出熒光峰(曲線c)。當(dāng)NC膜上包被檢測探針和質(zhì)控探針，且噴涂標(biāo)記探針時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)可檢測到明顯的熒光峰(曲線d)。結(jié)果證實，圖1中的檢測原理是可行的。

2.2 適配體介導(dǎo)的側(cè)向?qū)游龇ㄅc抗原抗體介導(dǎo)的免疫層析法的比較

比較了基于抗原抗體介導(dǎo)的膠體金免疫層析法與基于適配體介導(dǎo)的熒光微球側(cè)向?qū)游龇ā鹘y(tǒng)的膠體金免疫層析法檢測AFB1大多基于“競爭法”，即在金墊上包被膠體金標(biāo)記的AFB1抗體，在檢測線(T)處包被載體蛋白-AFB1結(jié)合物，在質(zhì)控線(C)處包被多抗。當(dāng)樣品中不含AFB1時，檢測線(T)和質(zhì)控線(C)處均有明顯的亮線(圖3A)；當(dāng)樣品中含有AFB1時，檢測線(T)處的亮線明顯減弱甚至消失(圖3B)。這說明了傳統(tǒng)膠體金方法的可行性。圖3C顯示了用適配體介導(dǎo)的膠體金側(cè)向?qū)游龇ǖ臋z測結(jié)果。將膠體金與圖1中的DNA分子發(fā)夾通過吸附作用結(jié)合后，包被在金墊上，Sequence 2和Sequence 3分別包被在檢測線和質(zhì)控線處。當(dāng)樣品中不含AFB1時，檢測線處幾乎觀察不到亮線，而質(zhì)控線處的亮線也非常弱(圖3C)；當(dāng)樣品中含有AFB1時，檢測線和質(zhì)控線處的亮線依然不明顯(圖3D)。這表明基于膠體金的側(cè)向?qū)游龇ú豢尚?。這可能是因為膠體金與DNA分子發(fā)夾通過吸附的方式作用，當(dāng)DNA分子發(fā)夾與AFB1形成復(fù)合物，或者DNA分子發(fā)夾與Sequence 3形成 DNA雙鏈時，膠體金與DNA之間的作用力不足以將膠體金與復(fù)合物或者雙鏈吸附[26-28]，以至于形成的復(fù)合物或者DNA雙鏈無法將膠體金留在檢測線或者質(zhì)控線處，因此無論樣品中是否有AFB1，檢測線和質(zhì)控線處的亮線均非常微弱。當(dāng)用熒光微球取代膠體金時，熒光微球與DNA分子發(fā)夾通過共價偶聯(lián)。相比于樣品中無AFB1時的結(jié)果(圖3E)，當(dāng)樣品中含有AFB1時，檢測線處出現(xiàn)明顯的熒光亮線(圖3F)。這可能是因為用共價鍵的方式將熒光微球與DNA分子發(fā)夾偶聯(lián)時，即使形成了復(fù)合物或者DNA雙鏈，但熒光微球作為熒光探針依然與復(fù)合物或者DNA雙鏈偶聯(lián)。綜上所述，基于適配體的膠體金側(cè)向?qū)游龇ú豢捎?，而基于適配體的熒光微球側(cè)向?qū)游龇ㄊ强尚械摹?/p>

2.3 標(biāo)記探針濃度的影響

測試樣本的質(zhì)量濃度為10 μg/L，檢測探針的包被濃度為1 μmol/L，對標(biāo)記探針的噴涂濃度進行了研究。發(fā)現(xiàn)在相同條件下，隨著標(biāo)記探針噴涂濃度變化，檢測區(qū)熒光峰強度(T)和質(zhì)控區(qū)的熒光峰強度(C)均有顯著變化。當(dāng)用0.1 mg/mL的標(biāo)記探針進行噴涂時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光峰強度均非常弱，表明此時噴涂的標(biāo)記探針量不足。當(dāng)用0.5 mg/mL的標(biāo)記探針進行噴涂時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光峰強度顯著增強。當(dāng)用1 mg/mL和2 mg/mL的標(biāo)記探針噴涂時，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光峰強度與0.5 mg/mL標(biāo)記探針噴涂時相差不大。考慮到標(biāo)記探針的濃度太高會增加成本，且可能會影響標(biāo)記探針的層析效率。因此，選擇0.5 mg/mL的標(biāo)記探針進行后續(xù)實驗。

2.4 檢測探針濃度的影響

對檢測探針的包被濃度進行研究。發(fā)現(xiàn)在相同條件下，隨著樣本中AFB1濃度的升高，檢測區(qū)熒光峰強度(T)和質(zhì)控區(qū)熒光峰強度(C)的比值(T/C)均會增加。當(dāng)檢測探針濃度為0.1 μmol/L時，隨樣本濃度的升高，T/C值增加不大，而且當(dāng)樣本質(zhì)量濃度大于10 μg/L時，出現(xiàn)hook現(xiàn)象。當(dāng)檢測探針濃度增至0.5 μmol/L時，隨樣本質(zhì)量濃度的升高，T/C值的增幅有所提高，但當(dāng)樣本質(zhì)量濃度為50 μg/L時，T/C值的增加趨勢下降，表明此條件下的線性范圍不寬。當(dāng)檢測探針濃度增至1 μmol/L時,T/C值與樣本質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。當(dāng)檢測探針濃度增至2 μmol/L時，隨樣本質(zhì)量濃度的升高，T/C值與檢測探針濃度為1 μmol/L時無顯著區(qū)別。因此，選擇檢測探針的濃度為1 μmol/L。

2.5 基于側(cè)向?qū)游龇ǖ脑嚰垪l檢測AFB1

圖4顯示了不同濃度的AFB1對T和C的影響。結(jié)果表明，隨著AFB1濃度的增加，T增加明顯。當(dāng)AFB1的質(zhì)量濃度在0.1～50 μg/L時，T/C與AFB1的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.059 6X+0.076 0，r2=0.993 3，其中Y為T/C值，X為樣本的質(zhì)量濃度(μg/L )?；?倍信噪比(S/N=3)計算得到檢出限為0.05 μg/L。

比較了現(xiàn)有方法及本方法的檢出限及檢測范圍(表2)。從表2可以看出，本方法的靈敏度更高，檢測更快速。

表2 AFB1檢測方法的主要參數(shù)對比Table 2 Comparison of major characteristics of common method used in the determination of AFB1

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

由于一步反應(yīng)，且不清洗，因此側(cè)向?qū)游龇y試中常存在基質(zhì)干擾。本實驗選取2、10 μg/L兩個質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別添加到?jīng)霾?本底濃度2.03 μg/L)、生脈飲(本底濃度0.81 μg/L)、急支糖漿(本底濃度1.23 μg/L)3種基質(zhì)樣品中(按照1∶9的體積比添加)，進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果如表3所示。樣本的回收率為84.9%～113%，表明本方法受基質(zhì)效應(yīng)影響不大。

表3 AFB1試紙條的回收實驗Table 3 Spiked recoveries test of the AFB1 strip

2.7 特異性實驗

在優(yōu)化條件下，以黃曲霉毒素M1(AFM1)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮為干擾物，考察了本方法對AFB1檢測的特異性。在相同條件下，將上述6種不同物質(zhì)分別滴加到AFB1試紙條中，反應(yīng)一段時間后用熒光測試儀檢測體系的T/C。結(jié)果表明，100倍AFB1濃度的上述5種對照物質(zhì)得到的T/C，與空白對照基本一致。而10 μg/L 的AFB1得到的T/C為0.724，表明基于側(cè)向?qū)游龇ǖ腁FB1試紙條對AFB1的檢測具有很好的特異性。

2.8 實際樣品中AFB1的檢測

按照“1.7”方法分析檢測了涼茶、生脈飲、急支糖漿3個樣品中AFB1的含量。同時用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)方法進行檢測，作為對照。測試結(jié)果如表4所示，兩種方法對3種不同基質(zhì)樣本測試結(jié)果的相關(guān)性較好。

表4 AFB1試紙條和LC-MS檢測實際樣品結(jié)果Table 4 The results of AFB1 strip and LC-MS for the real sample

3 結(jié) 論

本文基于側(cè)向?qū)游龇?gòu)建了一種AFB1檢測的試紙條。該方法原理在于樣品中AFB1與標(biāo)記探針中的DNA分子發(fā)夾結(jié)合后，形成的復(fù)合物在檢測區(qū)能夠被檢測探針捕獲，通過一個“off-on”的熒光信號，實現(xiàn)對AFB1的高靈敏檢測。該方法具有高靈敏、高特異性的優(yōu)點，并能用于實際樣品中AFB1含量的分析。該方法具有較好的實用性，但其在各種溶液配方以及工藝條件等方面有待進一步優(yōu)化，以優(yōu)化檢測體系、提高標(biāo)記效率、降低檢出限。

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