江西農(nóng)業(yè)大學校園大型真菌大時間尺度物種變化研究

張俊波，宋海燕，吳均山，江 可，霍光華，胡頌平，胡殿明

（江西農(nóng)業(yè)大學 江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌 330045）

大型真菌在自然生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用， 是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分； 許多大型真菌種類具有食用、藥用等重要經(jīng)濟價值，是重要的生物資源。了解大型真菌物種的時空變化規(guī)律是保護和利用該類資源的基礎。然而，現(xiàn)有大型真菌資源調(diào)查研究主要針對大型真菌的空間分布[1-12]， 在時間變化規(guī)律方面的研究鮮有報道，偶有相關報道[2,4,13-15]也 是季節(jié)性變化研究，其研究的時間尺度一般不超過一年。研究大時間尺度(5 年以上)變化規(guī)律對了解大型真菌的生物學和生態(tài)學特點，及對其進行保護利用等都具有重要意義。本研究以江西農(nóng)業(yè)大學校園為主要研究地點，在大時間尺度上長期跟蹤研究，以探索其變化規(guī)律。

江西農(nóng)業(yè)大學校園位于江西省中偏北部，贛江、撫河下游，鄱陽湖之濱，南昌市東北面，梅嶺腳下，總占地面積 1.6萬畝[16-17]， 地處東經(jīng) 115°27′～116°35′、北緯 28°09′～29°11′。常年氣候濕潤溫和、雨量充沛、日照充足，無霜期長、冰凍期短，屬典型中亞熱帶濕潤季風型氣候[17-18]。 年平均氣溫在 17～17.7 ℃，年均降水量在 1 600～1 700 mm，年平均相對濕度為 78.5%[17]， 適合于各類植物和花卉的生長。校園內(nèi)共有木本植物 88 科 274 屬 412 種，裸子植物 8 科 22 屬 29 種，被子植物 80 科 225 屬 383 種，其中常綠樹種有 200種，占總數(shù) 48.5%[16]； 落葉樹種有 212 種，占總數(shù) 51.5%，兩者比例接近 1：1[16]； 就株型而言，其中喬木198 種，占總數(shù) 48%；灌木 177種，總數(shù) 43%；藤本植物 37種，總數(shù)9%；三者比例約為 5：4：1[16]。 校園內(nèi)植物多樣性及優(yōu)越的自然地理條件和生態(tài)環(huán)境孕育了豐富多樣的大型真菌。

本課題組于2009 年開始對江西農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)大型真菌資源進行了初步調(diào)查，并于 2011 年完成第一次調(diào)查，采集標本 115份，鑒定為 76 種[1]。 為了長期跟蹤調(diào)查江西農(nóng)業(yè)大學校園大型真菌的物種多樣性，探索同一地點的真菌物種在較長時間跨度的物種變化規(guī)律，本課題組一直對江西農(nóng)大校園大型真菌進行調(diào)查，并補充記錄了校園內(nèi)大量以前未發(fā)現(xiàn)的物種。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本團隊于 2009 年 9 月—2011 年 11 月（第一次調(diào)查）及 2015 年 9 月—2017年 10 月（第二次調(diào)查），先后兩次對江西農(nóng)業(yè)大學校園本部為主各進行了為期2 年的大型真菌資源調(diào)查，采集的標本均保存于江西農(nóng)業(yè)大學真菌標本館 (The Herbarium of Fungi, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, China，HFJAU)。

1.2 調(diào)查方法

在學校本部采用踏查采集標本，且在大型真菌生長高峰期不定時頻繁多次的調(diào)查采集大型真菌樣品。對發(fā)現(xiàn)的所有大型真菌子實體進行現(xiàn)場攝影并采集，詳細記錄標本宏觀形態(tài)及生境、習性及基質(zhì)等相關信息，保持標本完整性帶回實驗室保存。

1.3 菌株分離與干標本制作

將采集的新鮮子實體帶回實驗室，采用組織分離和孢子彈射法進行菌株分離，并純化保藏于江西農(nóng)業(yè)大學菌種保藏中心(Culture Collection of Jiangxi Agricultural University, JAUCC)。取 剩余子實體一部分用硅膠干燥制作成干標本用于以后基因測序，剩余部分使用烘干器直接烘干，做成干制標本保藏。

1.3.1 組織分離法 使用酒精棉球?qū)⒆訉嶓w外表的土壤及雜質(zhì)清理干凈，用滅菌后的刀片從菌蓋中央將子實體切為兩半，將菌蓋與菌柄連接處的組織切為小塊，用滅菌針頭挑取組織小塊接種至提前做好的 PDA培養(yǎng)基上，待長出菌絲后純化。

1.3.2 孢子彈射法 先將濾紙中間打直徑為 0.5 cm的小孔，121 ℃滅菌 30 min，冷卻待用（濾紙需比培養(yǎng)皿大）。用酒精棉球?qū)⒆訉嶓w外表的土壤及雜質(zhì)清理干凈，切取比濾紙孔稍大的菌蓋，將無菌且打好孔的濾紙放在培養(yǎng)皿上，然后把切好的菌蓋輕放于濾紙孔上，菌褶朝下，再將皿蓋蓋在濾紙上方。幾小時后取出濾紙和菌蓋，蓋上皿蓋，25℃培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后純化。

1.3.3 硅膠標本 切取 2 cm組織塊用衛(wèi)生紙包住，置 入小號自封袋，向 其倒入變色硅膠蓋住組織塊后封口。若變色硅膠變色較明顯，說明水分很多，需再加入變色硅膠，直至硅膠變色不明顯，子實體完全干燥為止。

1.4 鑒定方法

廣泛查閱大型真菌相關的彩色圖譜及分類學專著[19-22]，采用宏觀特征和顯微結(jié)構(gòu)觀察等方法，對采集標本進行綜合分析鑒定，正確界定科名、屬名和種名，并對其經(jīng)濟應用價值和生態(tài)習性等進行歸納統(tǒng)計。

本研究以分離得到的純菌株為材料，采用 CTAB 法提取總 DNA[11]。 提取過程直接采用 Mix 混合試劑，PCR 擴增引物為：ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[23]。 PCR擴增條件為 95 ℃預變性 5 min，95 ℃變形 40 s，50 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)，72 ℃后延伸 10 min，1 0 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果；電 泳回收 PCR 產(chǎn)物，使 用了 2×TaqDNA PCRMasterMix（MT201）、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（DH101）回收 PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物送北京博邁德生物有限公司測序，使 用美國 ABI公司測序儀器(ABI 3030XL)，及 測序試劑盒 (ABI BigDye Terminator v3.1)進行測序[11]。所得序列在 NCBI上進行 Blast比對，進行初步的分子鑒定。

2 調(diào)查結(jié)果

2.1 江西農(nóng)業(yè)大學校園大型真菌物種資源

本次調(diào)查為第二次調(diào)查，共采集大型真菌標本 160 余份（表 1）， 鑒定子囊菌門 2 目3 科 3屬 5 種，擔子菌門 9目 31科 54屬 104種，合計 109 種，其中腐生菌 61種，共生菌6 種，寄生菌 1種，菌根菌41 種；食用菌 50 種，藥用菌10 種，食藥兩用菌 8 種，毒菌10 種，分離純化獲得菌株 56 株。第一次調(diào)查鑒定擔子菌門 7目 27科 42屬 74 種。兩次合計169 種。

2.2 大時間尺度物種變化

兩次調(diào)查共采集大型真菌 42科，其中，第一次調(diào)查采集 27 科，第二次調(diào)查采集 34 科，兩次調(diào)查都采集到的有18科，占總數(shù)的42.9%，即：Agaricaceae, Amanitaceae, Auriculariaceae, Clavariaceae, Entolomataceae,Fomitopsidaceae, Hygrophoraceae, Hymenochaetaceae, Lyophyllaceae, Marasmiaceae, Mycenaceae, Omphalotaceae,Physalacriaceae, Polyporaceae, Psathyrellaceae, Stereaceae, Strophariaceae, Tricholomataceae。

表1 兩次調(diào)查的大型真菌科、屬、種統(tǒng)計

兩次調(diào)查共采集大型真菌 169 種，其中，第一次采集74 種，第二次采集109 種。兩次調(diào)查都采集到的大型真菌有 13 種，占總數(shù)的 7.7%，即：紫褐蘑菇（A. rubellus） 、耳匙菌（A. vulgare） 、頭狀禿馬勃（C.craniiformis） 、云芝（C. versicolor） 、粉迷孔菌（D. biennis） 、漏斗大孔菌（F. arcularius） 、硬柄小皮傘（M.oreades） 、長根奧德蘑（O. radicata） 、草地小脆柄菇（P. campestris） 、白黃小脆柄菇（P. candolleana） 、喜濕小脆柄菇（P. hydrophila） 、根白蟻傘（T. eurrhizus） 、東方栓菌（T. orientali） 。第一次調(diào)查采集到，而在第二次調(diào)查中未采集到的大型真菌有 60種，占總數(shù)的 35.5%。第二次調(diào)查采集到，而在第一次調(diào)查中沒有采集到的有 96種，占總數(shù)的 56.8%。

表2 兩次調(diào)查不同生長習性真菌數(shù)量統(tǒng)計 種

表3 兩次調(diào)查不同經(jīng)濟價值真菌數(shù)量統(tǒng)計 種

表4 第二次調(diào)查大型真菌物種名錄

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

3 小結(jié)與討論

3.1 江西農(nóng)業(yè)大學校園大型真菌資源

通過對江西農(nóng)業(yè)大學校園大型真菌大時間尺度的調(diào)查，共鑒定大型真菌 42 科，81 屬，169 種（表 4），其中傘菌科種類最多，達 25 種，占全部種類的 14.8%；多孔菌科 12 種，占總數(shù)的 7.1%；紅菇科 11 種，占總數(shù)的 6.5%；3科真菌種數(shù)占總數(shù)的 28.4%。

按不同的生長習性劃分（表2），腐生菌 101 種，占總數(shù)的 59.8%，外生菌根菌 60 種，占總數(shù)的 35.5%；共生菌 7 種，占總數(shù)的 4.1%；寄生菌 1 種，占總數(shù)的 0.6%。腐生菌物種數(shù)量過半，占絕對優(yōu)勢，這可能是因為校園內(nèi)小林地面積較大倒木及枯枝落葉等多年積累，為腐生菌提供了適宜的生長環(huán)境。按經(jīng)濟價值劃分（表 3），校園內(nèi)大型真菌包括食用菌 77 種，占總數(shù)的 45.6%；藥用菌 16種，占總數(shù)的 9.5%；食藥用菌 8 種，占總數(shù)的 4.7%；有毒菌 25 種，占總數(shù)的 14.8%。

食用與藥用菌共占 59.8%，其中有8 種為食藥兼用菌，即：頭狀馬勃（C. craniiformis）、 大禿馬勃（C.gigantea）、 墨汁鬼傘（C. atramentarius）、 網(wǎng)紋馬勃（L. perlatum）、 硬柄小皮傘（M. oreades）、 菌核側(cè)耳（P.tuber-regium）、 大孢硬皮馬勃（S. bovista）、 橙黃硬皮馬勃（S. citrinum）， 其中菌核側(cè)耳已經(jīng)實現(xiàn)大規(guī)模的人工栽培，充分的發(fā)揮其菌核的藥用價值且為農(nóng)戶帶來了經(jīng)濟效益[24-26]； 柱狀田頭菇（A. cylindracea）、 盾形木耳（A. peltata）、 哥倫比亞側(cè)耳（P. columbinus）、 巨大革耳（P. giganteus）等食用菌已經(jīng)實現(xiàn)人工栽培，且深受人們喜愛；雞樅菌（T. albuminosus）、 根白蟻傘（T. eurrhizus）、 裂紋白蟻傘（T. schimperi）、 條紋白蟻傘（T. striatus）、 灰褐紋白蟻傘（T. striatusf. griseus）、 黃褐紋白蟻傘（T. striatusf. ochraceus）、 端圓白蟻傘（T. tylerianus）， 這一類統(tǒng)稱為雞樅菌，是一種味道鮮美、營養(yǎng)價值極高的食用菌，尤其是在云南極其受消費者喜愛，由于這一類真菌和蟻共生，所以導致目前還未能實現(xiàn)人工栽培，致使野生雞樅菌價格居高不下；藥用菌有江西蟲草（草木王）（C. jiangxiensis）、 大禿馬勃（C. gigantea）、 云芝（C. versicolor）、 喜熱靈芝（G. calidophilum）、 靈芝（G. lucidum）等，其中江西蟲草為江西省特有蟲草之一，是江西民間應用的一味珍稀名貴草藥，主要用于治療各種毒蛇咬傷[27-28]；云芝的多糖成分能提高人體免疫力，具保肝、抗癌等功效[29-30]。 我國食藥用菌眾多[31-32]， 但被人們認知利用的卻很少，亟待更多的開發(fā)利用。

本研究分離到菌株 56株，其中包括食用菌柱狀田頭菇（A. cylindracea）、 盾形木耳（A. peltata）、 長根奧德蘑（O. radicata）、 哥 倫比亞側(cè)耳（P. columbinus）、 弗 羅里達側(cè)耳（P. floridanus）、 巨 大革耳（P. giganteus）、菌核側(cè)耳（P. tuber-regium）、 雞樅菌（T. albuminosus）、 黃褐紋白蟻傘（T. striatusf. ochraceus）、 端圓白蟻傘（T. tylerianus）等；藥用菌大禿馬勃（C. gigantea）、 江西蟲草（C. jiangxiensis）、 云芝（C. versicolor）、喜熱靈芝（G. calidophilum）、 靈芝（G. lucidum）、 橙黃硬皮馬勃（S. citrinum）等。其中如柱狀田頭菇、盾形木耳、長根奧德蘑、巨大革耳等食用菌和喜熱靈芝、靈芝等藥用菌及菌核側(cè)耳等是藥用菌，現(xiàn)已經(jīng)實現(xiàn)人工栽培，本研究所分離得到的這一部分菌株可作為遺傳育種材料。雞樅菌、黃褐紋白蟻傘、端圓白蟻傘等食用菌和大禿馬勃、江西蟲草等藥用菌由于還未能夠人工栽培，所以可作為馴化栽培的重要菌種資源及食藥用價值進一步研究開發(fā)利用。

3.2 大時間尺度物種變化

本團隊在2009年9月—2011年11月對梅嶺高校區(qū)大型真菌資源的首次調(diào)查研究，共 采集標本115號，鑒定出 74 種大型真菌，占兩次調(diào)查總物種數(shù)的 43.8%，另有 3 種鑒定到屬，共采集 77 種[1]。 第二次調(diào)查采集到大型真菌 109種，占總物種數(shù)的 64.5%，其中 96 種在上次調(diào)查中沒有采集到，占兩次調(diào)查物種總數(shù)的 56.8%。由 此可見，對 一個地域短時間調(diào)查(調(diào)查1次或 1 年調(diào)查多次)所得結(jié)果難以反應該地域大型真菌真實的物種情況。另一方面，在上次調(diào)查所采集的 74種中，有 60種在本次調(diào)查中未采集到（表 4），占總物種數(shù)的 35.5%。這 60 種大型真菌有可能由于人為破壞、營養(yǎng)消耗殆盡、氣候變化、植被變化等各種原因在江西農(nóng)業(yè)大學校園消失了，或者在這次調(diào)查的 2 年期間沒有產(chǎn)生子實體。兩次調(diào)查所得大型真菌物種差異較大，只有 13 種是相同的，分別為：紫褐蘑菇（A. rubellus）、 耳匙菌（A. vulgare）、 頭狀禿馬勃（C.craniiformis）、 云芝（C. versicolor）、 粉迷孔菌（D. biennis）、 漏斗大孔菌（F. arcularius）、 硬柄小皮傘（M.oreades）、 長根奧德蘑（O. radicata）、 草地小脆柄菇（P. campestris）、 白黃小脆柄菇（P. candolleana）、 喜濕小脆柄菇（P. hydrophila）、 根白蟻傘（T. eurrhizus）、 東方栓菌（T. orientalis）， 其中根白蟻傘為共生菌，頭狀禿馬勃為菌根菌，其它均為腐生菌；這一類真菌能夠長期生存于校園內(nèi)，說明適合于它們生長的環(huán)境未受到破壞。這兩次調(diào)查差異較大的主要原因可能為：兩次調(diào)查相隔四年之久，近幾年校園規(guī)劃的改變、生境變化或受采集季節(jié)性、隨機性及人為等因素影響，可能改變了部分物種的生長環(huán)境，致使兩次采集鑒定結(jié)果重復性不高；部分真菌子實體的產(chǎn)生具有年周期性，幾年為一結(jié)實周期，例如：大禿馬勃、端圓白蟻傘、葉綠紅菇等部分大型真菌，在同一位置時隔 3年二次采集到。

根據(jù)本研究的結(jié)果，用傳統(tǒng)的踩踏采集大型真菌子實體的調(diào)查法，連續(xù) 2年多次調(diào)查所得大型真菌物種數(shù)占總物種數(shù)的 44.4%～63.7%?？紤]到森林、山地等自然生境往往比校園面積大得多，且由于道路難行、時間有限等原因，難以做到全方位的覆蓋的踩踏調(diào)查，因此，現(xiàn)有傳統(tǒng)資源調(diào)查方法所得物種數(shù)可能占實際物種數(shù)的一半不到。再加上有些大型真菌具有特殊的結(jié)實周期性，實際物種數(shù)可能還更多。要摸清我國大型真菌資源家底，不僅要加強對新地域資源的調(diào)查，對于已經(jīng)有調(diào)查數(shù)據(jù)的地區(qū)，也應該重復調(diào)查，并且可以采用現(xiàn)代分子技術輔助調(diào)查。

致謝：江西科技師范大學趙寬老師對牛肝菌屬進行了鑒定，謹致謝意！

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