廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的分子保護(hù)作用研究

李冠烈，湯少嫻，饒智華，牛丞威，陳樂(lè)詩(shī)，陳澤程，張韋深，龍?zhí)斐?，汪雪蘭，劉瓊*

（1.中山大學(xué) 新華學(xué)院，廣東廣州 510520；2.中山大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510520）

冠心病（coronary heart disease，CHD）對(duì)中老年人的健康有著嚴(yán)重的影響，隨著人們生活方式的改變、飲食結(jié)構(gòu)的變化，該病癥逐步發(fā)生在青年人群中[1-2]。引起該病癥的主要原因是心肌缺血后產(chǎn)生大量的活性氧自由基，對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷，復(fù)灌后導(dǎo)致氧化損傷加重[3-4]。研究有效的治療缺血再灌注損傷的藥物，改善CHD患者的治療效果，有重要意義。

中醫(yī)在治療方面，以中草藥為主，對(duì)心肌缺血的預(yù)防和保護(hù)有較大進(jìn)展。其中，總黃酮因能夠保護(hù)心腦血管、抗癌而受到醫(yī)學(xué)研究的重視。廣金錢(qián)草的統(tǒng)一藥用名稱(chēng)源于《嶺南草藥志》，在治療泌尿系感染、泌尿系結(jié)石、小兒疳積、癰腫等方面，有較好的治療效果[5-6]。有報(bào)道，極性較大黃酮能增加狗在體心臟冠脈流量及減少心肌耗氧量，可能和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、減少心肌耗氧量，改善心肌缺氧有關(guān)系[7-9]。因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，各種成分含量低，研究技術(shù)手段等制約了對(duì)其心肌缺血保護(hù)作用機(jī)制的進(jìn)一步研究。國(guó)外對(duì)廣金錢(qián)草研究主要集中在其生物堿、黃酮苷、酚類(lèi)等各物質(zhì)的化學(xué)成分的構(gòu)成上，對(duì)廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)心臟缺血/再灌注損傷的分子保護(hù)作用研究暫未見(jiàn)太多報(bào)道[10-11]。大鼠的冠脈走形和血液循環(huán)途徑與人類(lèi)接近，模型穩(wěn)定性較好，可用于探索研究。離體心臟不受神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)，影響因素較少、可控性強(qiáng)，是一種可選模型[12]。本文研究了廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的分子保護(hù)作用，采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)復(fù)制心肌缺血模型，通過(guò)設(shè)置對(duì)照組和4個(gè)不同濃度用藥組，觀察廣金錢(qián)草黃酮是否對(duì)心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用，初步探討從分子水平對(duì)心肌保護(hù)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用以及中藥進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar大鼠25只，體重300～350 g，平均體重為（321.46±7.48）g。

實(shí)驗(yàn)藥品：肝素鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022051），戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司，高級(jí)純），其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：Langendorff、恒溫水浴、電子天平、pH儀、蠕動(dòng)泵、多導(dǎo)生理儀、縫合針和導(dǎo)管等。

1.2 建立大鼠離體心臟缺血/再灌注模型

大鼠斷頭后，迅速開(kāi)胸，取出心臟，洗凈血液，迅速轉(zhuǎn)移、固定，常規(guī)恒壓灌流，維持灌流液溫度37 ℃。缺血/再灌注的過(guò)程為平衡20 min，停止灌流30 min，復(fù)灌120 min。

1.3 方法

采用2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》廣金錢(qián)草總黃酮制備方法。

稱(chēng)取廣金錢(qián)草干品約6g，加80mL95%乙醇，超聲波提2.5h，抽濾。濾渣以同法提取2.5h，抽濾，兩次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，將濃縮液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，得樣品液，測(cè)得樣品中總黃酮的含量C=0.148mg/mL。

大鼠25只，分5組，分別是對(duì)照組（僅做灌流，不停灌和用藥）、A組（停灌前未用廣金錢(qián)草總黃酮處理）、B組（廣金錢(qián)草總黃酮低濃度1 μg/mL）、C組（廣金錢(qián)草總黃酮中濃度10μg/mL）、D組（廣金錢(qián)草總黃酮高濃度100 μg/mL），具體如下。采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)記錄心臟功能。大鼠斬頭后，迅速開(kāi)胸腔取出心臟，經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行插管，心臟懸掛于Langendoff灌流裝置上，用37 ℃氧飽和的K-H液，充以5%CO2和95%O2混合氣體20 min，調(diào)節(jié)其pH值為7.35～7.40，灌流方法為恒溫、恒壓逆向灌流，灌流壓力設(shè)定為11 kPa。經(jīng)房室口將一注水球囊插入左心室，小囊經(jīng)導(dǎo)管和壓力換能器進(jìn)行連接，把左心室內(nèi)壓輸入Powerlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，進(jìn)行信號(hào)的自動(dòng)采集、記錄。對(duì)心肌梗死及氧化應(yīng)激損傷測(cè)定心臟，復(fù)灌時(shí)間延長(zhǎng)至120 min。各組僅在廣金錢(qián)草總黃酮所用濃度方面有差異，其他均一致。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死程度、冠脈流出液中LDH含量的影響。

大鼠Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，采用ADInstruments公司的設(shè)備及配套PowerLab信號(hào)采集分析系統(tǒng)。

心肌梗死面積測(cè)定：冷凍保存、切片、TTC 染色、拍照、用Motic Med 6.0圖像分析系統(tǒng)分析處理圖像、計(jì)算百分比。

心臟流出液中乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)，用南京建成生物技術(shù)公司的試劑盒，用分光光度法檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行本研究數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用（x-±s）表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用百分比（%）表示，分別用t和x2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)的影響

廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)的影響見(jiàn)表1。結(jié)果表明，大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)在復(fù)灌期間都出現(xiàn)了異常，和生理鹽水組比較，A組的RPP、±dP/dtmax、CF均顯著下降，表明缺血/復(fù)灌模型建立成功。不同濃度的廣金錢(qián)草總黃酮能夠改善缺血缺氧引起的血流動(dòng)力學(xué)改變，減輕因缺血/再灌注造成的心肌損傷，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注心肌梗死程度的影響

廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注心肌梗死程度的影響見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，離體心臟停灌前，采取廣金錢(qián)草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以調(diào)節(jié)心肌formazan含量，降低心肌梗死面積，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注心肌梗死程度的影響

2.3 對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注冠脈流出液中LDH含量的影響

表1 廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注血流動(dòng)力學(xué)的影響（x-±s）

廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注冠脈流出液中LDH含量的影響見(jiàn)圖2。離體心臟停灌前，采取廣金錢(qián)草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以降低心肌冠脈流出液中LDH的含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖2 廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注冠脈流出液中LDH含量的影響

3 討論

研究結(jié)果顯示，不同濃度的廣金錢(qián)草總黃酮均能改善缺血缺氧引起的血流動(dòng)力學(xué)改變，減輕因缺血/再灌注造成的心肌損傷，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。血流動(dòng)力學(xué)是評(píng)價(jià)心功能的主要參數(shù)。由此證實(shí)，廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)于改善缺血/再灌注造成的心肌損傷方面，能夠改善心臟功能，效果較好。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，廣金錢(qián)草有利膽、利尿、抗泌尿系結(jié)石、對(duì)心血管系統(tǒng)有影響、抗炎、鎮(zhèn)痛抗菌、益智、對(duì)血液有影響等[13-14]。急性心肌缺血損傷，梗死面積的大小直接影響到治療效果[15-16]。研究結(jié)果顯示，離體心臟停灌前，采取廣金錢(qián)草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以改善心肌formazan含量，降低心肌梗死面積，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。縮小心肌梗死的面積，是治療效果的主要判斷依據(jù)。

LDH廣泛存在于細(xì)胞漿膜中，在正常情況下，其含量降低。研究結(jié)果顯示，離體心臟停灌前，采取廣金錢(qián)草總黃酮進(jìn)行預(yù)處理，和A組比較，可以降低心肌冠脈流出液中LDH的含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。由于發(fā)生了細(xì)胞膜和線粒體的損傷，使得細(xì)胞膜的通透性增加，造成LDH的變化。其水平降低，表明減少了心肌損傷的情況。

總之，廣金錢(qián)草總黃酮對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷有較好的分子保護(hù)作用，可以減輕因缺血/再灌注造成的心肌損傷，改善心肌formazan含量，降低心肌梗死面積，降低心肌冠脈流出液中LDH的含量。

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