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      微生物制藥中菌種準(zhǔn)備方法及改進(jìn)

      2018-07-09 10:58:24王麗琴
      生物化工 2018年3期
      關(guān)鍵詞:供種菌絲體斜面

      王麗琴

      (杭州中美華東制藥有限公司,浙江杭州 310000)

      微生物制藥主要利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的有生理活性的產(chǎn)物,針對生產(chǎn)過程的特殊性,在整個過程中需要明確實際類型,結(jié)合制藥類型和模式等實施。當(dāng)前,微生物制藥實驗管理程度復(fù)雜,考慮到代謝條件以及相關(guān)實驗設(shè)備等因素,要從實驗環(huán)節(jié)入手,提升生產(chǎn)管理水平。為了保證生物菌種的安全性,要求實驗人員從各個實驗環(huán)節(jié)做好準(zhǔn)備工作,滿足微生物制藥要求。

      1 傳統(tǒng)的供種方法

      四環(huán)素是由金霉素鏈霉菌經(jīng)孢子制備、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和提取而獲得的。根據(jù)發(fā)酵以及提取精制過程可知,菌種制備是源頭,需要提前做好準(zhǔn)備工作,以滿足實驗要求。在初期制備階段,相關(guān)實驗人員進(jìn)行試驗、如下:36 ℃培養(yǎng)7天左右,以F1代子斜面,為了保證實驗所需數(shù)量和孢子質(zhì)量,要擴(kuò)大培養(yǎng)F2代子斜面,設(shè)計人員在實驗的過程中,按照不同類型要求進(jìn)行。傳統(tǒng)的供種模式存在很多問題。

      1.1 菌種的斜面轉(zhuǎn)接困難

      菌種的斜面轉(zhuǎn)接是用接種環(huán)輕輕沾取一個試管中少量菌體和孢子,轉(zhuǎn)接到另外一支待接斜面試管上,但由于實驗人員較多,需要重復(fù)轉(zhuǎn)接的斜面較多,考慮到整個過程的特殊性,在整個分析階段,需要高度重視,做好制備工作。

      1.2 斜面需求量大

      微生物生長的影響因素較多,可能存在生長情況不好的現(xiàn)象。技術(shù)人員要結(jié)合多年的經(jīng)驗,結(jié)合試驗菌的特征進(jìn)行,此外考慮到形態(tài)和生理變異等因素,為了保證給其他工作人員提供符合試驗要求的菌種,以試驗項目為基礎(chǔ),根據(jù)《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理方法》可知,需要提前確定使用規(guī)范,試驗結(jié)束后,對試管斜面提前處理,工作量較大,如果存在試驗制備不合理或者其他問題等,都可能造成不良影響[2]。

      1.3 供種時間性強(qiáng)

      受到其他因素的影響,如濕度、溫度和原材料等,菌種控制難度比較大,在整個處理階段,要做好處理工作。如果不能提前控制,菌種則易出現(xiàn)衰退、死亡或者變異等現(xiàn)象,導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降后,時間不好掌握[3]。

      1.4 出發(fā)菌株不能統(tǒng)一

      由于每個出發(fā)菌株的單一孢子轉(zhuǎn)接試管斜面的數(shù)量有限,不能保證所有研究人員所進(jìn)行的實驗組的使用生長情況一致,根據(jù)試驗數(shù)據(jù)實際情況可知,這種情況不利于發(fā)酵過程中代謝條件的開展。在微生物制藥實驗中,考慮到菌種的準(zhǔn)備形式以及異常情況,要提前進(jìn)行研究和實踐。

      2 改進(jìn)菌種準(zhǔn)備方式和可行性分析

      2.1 改進(jìn)方式

      由于菌種的類型較多,在整個分析階段,要了解菌絲體的實際情況。根據(jù)液體培養(yǎng)基的概況可知,震蕩培養(yǎng)的方式符合要求。以菌絲體保存方式為例,將震蕩培養(yǎng)后的菌絲體加保護(hù)劑后分裝至甘油管中,置于-28 ℃下進(jìn)行保存。冷凍菌絲體代替孢子斜面,將其提供給相關(guān)人員進(jìn)行項目試驗,如下:

      沙土管→孢子培養(yǎng)→母斜面→種子液→供種

      結(jié)合傳統(tǒng)的微生物制藥的模式可知,培養(yǎng)成熟孢子母斜面,以接種處理作為基礎(chǔ),在后續(xù)試驗中,要做好種子液處理工作。每瓶菌絲萌發(fā)的種子液可以分裝至多個甘油管中,置于合適的溫度下保存,完成后續(xù)試驗。該方式的優(yōu)勢明顯,種子和孢子斜面用量少,在實驗檢查階段,需要明確準(zhǔn)備方式和要求,嚴(yán)格按照試驗要求實施。斜面?zhèn)鞔臅r間和后續(xù)大量的菌種滅活后洗刷工作量提升,需要節(jié)約人力、物力等投入,減少感染機(jī)會,保證穩(wěn)定生產(chǎn)和管理。此外種子生長較快,能加速孢子發(fā)芽,根據(jù)對應(yīng)的菌種以及準(zhǔn)備周期可知,在改進(jìn)處理過程中要明確實際優(yōu)勢,提升了可行性。同一批次的菌絲體生長背景一致,在發(fā)酵過程中,考慮到代謝條件以及試驗設(shè)計等要求,要明確可行性指標(biāo),避免出現(xiàn)異常現(xiàn)象[4]。

      2.2 菌絲體凍存時間分析

      根據(jù)不同時間的菌絲體試驗條件可知,5%四環(huán)素接種量發(fā)酵過程中,采用新鮮的孢子斜面作為對照,能符合結(jié)果要求。凍存菌絲體作為試驗的主要部分,凍存兩周后,菌絲凍存時間延長后,四環(huán)素發(fā)酵單位呈現(xiàn)出下降趨勢,凍存1周后,菌絲變化不明顯,考慮到周期性變化和改進(jìn)流程可知,需要提前減少工作量[5]。

      2.3 菌絲體接種量對四環(huán)素發(fā)酵影響考察

      凍存時間以及菌絲體等屬于常見的試驗供種,結(jié)合不同接種量可知,在評價過程中,要提前處理,以新鮮孢子斜面供種為對照組,在測評階段要明確表格內(nèi)容,按照改進(jìn)格式要求實施。綜合分析試驗結(jié)果可知,在實驗調(diào)查過程中,要確定大范圍的結(jié)果。凍存1周的菌絲體供種發(fā)酵考察見表1。

      表1 凍存1周的菌絲體供種發(fā)酵考察

      菌絲體凍存的時間大約為7天,接種量為2 mL,轉(zhuǎn)種時間為22 h時,發(fā)酵單位和普通孢子發(fā)酵單位相當(dāng),如果沒有下降,則可以按照說明書代替?zhèn)鹘y(tǒng)斜面進(jìn)行處理。

      2.4 不同供種方式工作量對比

      根據(jù)微生物實驗檢測的實際要求可知,做好分組管理是關(guān)鍵。正常情況下,實驗項目分配后,要確定成熟孢子斜面類型,如果孢子不能符合實際要求,則準(zhǔn)備32支以上的孢子斜面。以試管裝量為前提,要提前確定培養(yǎng)基數(shù)量。改進(jìn)的供種方式需要一只斜面,挖塊1 cm×2 cm孢子接種到液體培養(yǎng)基內(nèi),震蕩培養(yǎng)是重要的過程,在簡化處理的過程中,要明確類型要求,簡化后的試驗處理是個重要的過程,洗刷后,要提前確定工作量[6]。

      2.5 確定培養(yǎng)周期

      根據(jù)改進(jìn)后的菌絲體供種類型可知,供種時間分為不同的類別,周期大約為1周。由于微生物制藥管理過程復(fù)雜,在實踐階段需要考慮到應(yīng)用周期和概況,做好斜面準(zhǔn)備以及孢子培養(yǎng)工作,確定斜面的數(shù)量。以試驗數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ),凍存菌絲體作為四環(huán)素發(fā)酵的供種來源,如何將其應(yīng)用到大范圍中是重點,以規(guī)?;芾碜鳛榛A(chǔ),復(fù)雜的培養(yǎng)管理后,能適當(dāng)減少試驗準(zhǔn)備操作,縮短時間。試驗準(zhǔn)備是個全面的過程,凍存2周后,四環(huán)素發(fā)酵單位呈現(xiàn)出下降的趨勢,考慮到應(yīng)用周期和其他方面因素的變化,在整個處理過程中要突出應(yīng)用重點。

      3 結(jié)語

      微生物制藥管理是個全面的過程,考慮到應(yīng)用周期以及具體變化,大規(guī)模實驗人員在實驗分析的階段,必須做好菌種準(zhǔn)備工作,考慮到實驗準(zhǔn)備操作以及時間等方面因素,生物廢品較多,做好后續(xù)處理工作是重點,要改善實驗環(huán)境,節(jié)約人力和物力投入等。實驗周期的確定也是重點,在評價過程中需要確定接種量,如果存在準(zhǔn)備不到位或者改進(jìn)措施不合理等現(xiàn)象,則直接影響試驗結(jié)果,因此需要從各個方面入手,做好改進(jìn)工作,最大程度滿足應(yīng)用要求,實現(xiàn)菌種合理性。

      [1]劉曉輝,郭萍,韓佳迪,等.微生物制藥實驗中菌種準(zhǔn)備方法改進(jìn)[J].實驗室科學(xué),2017,20(5):36-38,41.

      [2]裴立忠,王勇平,張鵬,等.四環(huán)素類抗生素生產(chǎn)狀況與市場發(fā)展前[J].中國獸藥雜志,2015,12(1):96-98.

      [3]何健勇.生物制藥工藝學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2016.

      [4]祝琳.微生物實驗室菌種復(fù)蘇傳代保存流程[J].山東化工,2014,43(1):105-106.

      [5]范慧.菌種管理在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].藥學(xué)研究,1999(1):60-62.

      [6]楊怡姝,沈思嗣,王小利,等.大學(xué)生物學(xué)實驗室的生物安全問題探討[J].實驗技術(shù)與管理,2011,28(5):188-190.

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