Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟的影響

王大清 郭繼彤 李喜和 趙高平 曹貴方

摘 要：該研究旨在探討外源Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟的調(diào)控作用。在成熟培養(yǎng)液中分別添加濃度為0、100、200和300ng/mL的Ghrelin，進行綿羊卵母細胞體外培養(yǎng)，成熟培養(yǎng)24h，觀察統(tǒng)計處于MII期的細胞數(shù)目。選擇最佳添加濃度，在體外成熟培養(yǎng)0、6、8、14、16、24h，通過Hoechst33342染色持續(xù)檢測卵細胞中細胞核成熟隨時間變化，并對不同培養(yǎng)時期細胞進行實時熒光定量PCR檢測，以證明細胞質(zhì)量相關(guān)基因的相對表達量。成熟培養(yǎng)24h時，添加0、100、200、300 ng/mLGhrelin組卵母細胞成熟率分別為：63.7% （220/345） 、69.4%（230/332）、85.6% （270/316）、75.9%（231/305）。200ng/mL Ghrelin組顯著高于對照組（P<0.01），其余組并未顯著高于對照組 （P<0.05）；染色證明：200ng/mL Ghrelin組于成熟培養(yǎng)0h、6h、14h、16h到達GV、GVBD、MI、MII期（P<0.05）；實時熒光定量PCR證明：對卵母細胞成熟GV、GVBD、MI、MII 期，Ghrelin受體基因GHSR-1a和卵母細胞質(zhì)量相關(guān)基因OCT-4、GLUT1 和IFNT 的相對表達時間提前，但并不顯著影響這些基因的表達水平。外源 Ghrelin參與了綿羊卵母細胞的體外成熟調(diào)控，可在沒有改變其成熟過程的前提下加速卵母細胞的體外成熟過程，但對綿羊卵母細胞的質(zhì)量和進一步發(fā)育相關(guān)的基因的表達沒有明顯影響。

關(guān)鍵詞：綿羊卵母細胞；Ghrelin；體外成熟

中圖分類號 S826 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）07-

Effects of Ghrelin on in Vitro Maturation of Ovine Oocytes

Wang Daqing1 et al.

（1College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Abstract：To study the regulation effect of exogenous Ghrelin in vitro maturation of sheep oocytes，0，100，200 and 300 ng/mL Ghrelin were added in mature culture medium，in vitro culture of sheep oocytes and 24h in mature culture，and the observation statistics were in the number of MII period. To choose the best dosage and mature in vitroculture 0，6，8，14，16，24 h，continuous detection of egg in the nucleus by dyeing Hoechst33342 mature and change over time，and the real-time fluorescent quantitative PCR to detect cell culture period，to show that cell quality relative expression of related genes. When the mature culture was incubated for 24h，the maturation rate of the oocytes of 0，100，200，300ng/mLGhrelin group was 63.7%（220/345），69.4%（230/332），85.6% （270/316） and 75.9%（231/305）. The 200ng/mL Ghrelin group was significantly higher than the control group（P<0.01），while the remaining group was not significantly higher than the control group （P<0.05）. The results showed that 200 ng/mL Ghrelin group was established in mature culture 0h，6h，14h，16h to GV，GVBD，MI，MII （P<0.05）. Real-time fluorescent quantitative PCR to prove：the GV oocytes mature，GVBD，MI，MII，Ghrelin receptor gene GHSR - 1a and oocyte quality related gene OCT - 4，the relative expression of GLUT1 and IFNT ahead of time，but not dramatically affect the gene expression level.exogenous Ghrelin participated in the sheep oocyte in vitro maturation regulation，under the premise of no change in the mature process can be accelerated in vitro maturation of oocytes，but the quality of sheep oocytes and related gene expression did not significantly affect the further development

Key words：Sheep oocytes；Ghrelin； In vitro maturation

Ghrelin是日本科學家Kojima于1999年首次發(fā)現(xiàn)的一種由28個氨基酸組成的新的內(nèi)源性腦腸肽，是生長激素促分泌素受體（Growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的天然配體[1]。Ghrelin在體內(nèi)分布廣泛，可能參與了多種組織的生理功能調(diào)控[2]。那么，Ghrelin在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)作中扮演著何種角色，探索外源Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟的調(diào)控機理對其后的體外受精、胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)基因克隆等技術(shù)有著重要意義。近來研究證實：Ghrelin參與了哺乳動物生殖功能的調(diào)控[3]。在不同動物物種中其作用不盡相同。在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時添加Ghrelin可提高豬體外受精和孤雌胚胎的囊胚發(fā)育率[4]；而在牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中，Ghrelin除了可加速卵母細胞的體外成熟，還抑制了其后體外受精胚胎的囊胚發(fā)育[5]。在綿羊卵母細胞體外成熟和受精卵的體外培養(yǎng)過程中添加低濃度Ghrelin可提高體囊胚的體外發(fā)育率，但高濃度則抑制外胚囊胚的發(fā)育[6]。

本研究在綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的Ghrelin，檢測并觀察不同濃度Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟率和卵母細胞核成熟時間的影響，篩選提高綿羊卵母細胞完全體外成熟率的最佳外源Ghrelin濃度。同時用實時熒光定量PCR技術(shù)對卵母細胞成熟不同時期細胞質(zhì)量相關(guān)基因的相對表達量進行了動態(tài)檢測，探討Ghrelin與綿羊卵母細胞體外成熟時期的相關(guān)性，認識并了解Ghrelin影響綿羊卵母細胞成熟的作用機理。進而通過在綿羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加最佳外源Ghrelin濃度，來有效提高綿羊卵母細胞體外成熟數(shù)量和質(zhì)量，為其后的體外受精、胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)基因克隆等技術(shù)提供最基礎(chǔ)、最有效保障。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗外源添加Ghrelin（PGH-3625-PI）購置于Peptides公司。HM199、M199、EGF、LH、DPBS、Gentamicin購于Gibco公司。胎牛血清是Biological Industries公司產(chǎn)品。The RNeasy? Mini Kit（cat.nos.74104）試劑盒購于Qiagen公司。GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒購于Promega公司。體視顯微鏡SMZ745T是Nikon公司生產(chǎn)。Real-Time PCR 儀（5100型號）是Thermo公司生產(chǎn)。微孔板迷你離心機（ZHmini-p25）為浙江藏漢科技有限公司產(chǎn)品。CO2培養(yǎng)箱（NUAIR-NU-5510E型號）為NUAIRE公司產(chǎn)品。綿羊卵巢采集自內(nèi)蒙古和林格爾內(nèi)蒙古蒙羊牧業(yè)股份有限公司屠宰車間。采集的卵巢置于含0.3mg/mL慶大霉素的生理鹽水，在22℃的保溫桶中1h內(nèi)運回實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 綿羊卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng) 將運回實驗室的綿羊卵巢先用75%酒精浸泡20～30s，之后用DPBS清洗3次，置于割卵液（90%HM199+10%FBS+2.5μg/mL

Heparin+50μg/ mLGentamicin）中，采用切割法收集2～6mm直徑的卵泡中的卵丘卵母細胞復(fù)合體（Cumulus oocyte complexes，COCs），在體視鏡下挑選具有3層以上卵丘細胞、胞質(zhì)均勻、形態(tài)正常的卵母細胞用于成熟培養(yǎng)。每50枚COCs放于含有600μL基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液（90%M199+10%FBS+0.3mm/mLSodiumpyruvate+0.1mm/mLCysteamine

+5μg/mLFH+5μg/mLLH+10μg/mLEGF+1μg/mLE2+50μg/mL

Gentamicin）的4孔板（Corning）中，4孔板中央添加2.5mL超純H2O，在38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行成熟培養(yǎng)。為了比較不同濃度梯度Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟的影響，分別設(shè)基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液中添加100、200、300ng/mL Ghrelin為實驗組；基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液中添加0ng/mL Ghrelin為對照組。然后分別于成熟培養(yǎng)24h收集培養(yǎng)的卵母細胞。統(tǒng)計卵母細胞處于：MII期成熟率百分比及標準誤差。

1.2.2 綿羊卵母細胞核成熟進程的檢測 基礎(chǔ)成熟液中添加0ng/mLGhrelin和200ng/mLGhrelin組，分別設(shè)為：對照組、實驗組。在熒光顯微鏡下，持續(xù)觀察對照組與實驗組中卵母細胞成熟過程中核發(fā)育形態(tài)隨時間的變化，以確定對照組、實驗組卵母細胞核成熟期（GV、GVBD、MI、MII）進程隨時間的變化。并于成熟培養(yǎng)0h、8h、16h、24h；0h、6h、14h、16h后分別收集各時間培養(yǎng)卵母細胞各100枚，分別放在含有0.1%透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液中振蕩去掉卵丘細胞，DPBS+0.3%BSA洗1遍，在加有PBS+4%多聚甲+0.2%TritonX-100的4孔板中，38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中固定通透1h，PBS+0.3%BSA洗3遍（0.3%的BSA起到封閉作用），用Hoechst 33342（5mg/mL）染色檢查卵母細胞核成熟GV、GVBD、MI、MII期核成熟進程。最后，用甘油：PBS按1∶1配制的封片液封片。熒光顯微鏡400倍下，觀察核發(fā)育形態(tài)變化。并3次重復(fù)，統(tǒng)計不同核形態(tài)時期卵母細胞數(shù)目隨時間變化。

1.2.3 綿羊卵母細胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及OCT-4、GLUT1、IFNT、GHSR-1a、GHSR-1a和GAPDH基因的熒光定量PCR檢測

1.2.3.1 綿羊卵母細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照The RNeasy? Mini Kit（cat.nos.74104）微量RNA提取試劑盒的說明書從不同體外成熟培養(yǎng)實驗組及對照組中提取總RNA。然后，將總RNA按照GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。-20℃保存，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3.2 實時熒光定量PCR引物設(shè)計 引物設(shè)計依據(jù)美國GenBank 公布的基因的序列，使用Primer6.0軟件計所需引物。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列（見表1）。

1.3 統(tǒng)計學分析 運用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計程序為：單因子方差分析（one-way ANOVA）、Tukey，s Multiple Comparison test。數(shù)據(jù)表示分別以：百分比：%和標準誤差：SEM；即：%±SEM，且每組卵母細胞個數(shù)多余100個，每組間重復(fù)3次，組間重復(fù)3次；t檢驗結(jié)果表示：a，p<0.01時為差異極顯著；b，p<0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟的影響 于體外成熟培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)的卵母細胞，統(tǒng)計卵母細胞處于MII期百分比。對照組：63.7%（P<0.05）；添加100ng/mL Ghrelin組：69.4%（P<0.01）、添加200ng/mL Ghrelin組：85.6%（P<0.01）、添加300ng/mL Ghrelin組：75.9%（P<0.01）。結(jié)果表明：添加100、200、300ng/mL Ghrelin在綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)均有一定的促進作用，其中添加200ng/mL Ghrelin組作用最為顯著（P<0.01），其中添加300 ng/mL Ghrelin組、100ng/mL Ghrelin組作用次之（P<0.01）（見表2）。

2.2 卵母細胞核成熟隨時間變化

2.2.1 Hoechst 33342對卵母細胞體外成熟培養(yǎng)細胞染色 結(jié)果顯示：對照組（A、B、C、D）：卵母細胞于體外培養(yǎng)的0h到達卵母細胞生發(fā)泡期（GV）：A、8h到達卵母細胞生發(fā)泡破裂期（GVBD）：B、16h到達卵母細胞第一次減數(shù)分裂中期（MI）：C、24h到達卵母細胞第二次減數(shù)分裂中期（MII）：D；實驗組（A′、B′、C′、D′）：卵母細胞于體外培養(yǎng)的0h到達GV：A′、6h到達GVBD：B′、14h到達MI：C′、16h到達MII：D′。結(jié)果表明：實驗組卵母細胞成熟過程中，細胞核發(fā)育形態(tài)趨勢和對照組基本一致（P<0.05）。

2.2.2 綿羊卵母細胞核成熟情況隨時間變化 對照組：卵母細胞體外成熟培養(yǎng)0h：97%到達GV期（p<0.01）、8h：52.46%到達GVBD期（p<0.01）、16h：54.54%到達MI期（p<0.01）、24h：56.42%到達MII期（p<0.01）；實驗組：卵母細胞體外成熟培養(yǎng)0h：92.54%到達GV期（p<0.01）；6h：62.77%到達GVBD期（p<0.01）、14h：66.84%到達MI期（p<0.01）、16h：64.03%到達MII期（p<0.01）。結(jié)果表明：實驗組在沒有改變卵母細胞成熟進程的同時，對綿羊卵母細胞體外成熟有一定的加速作用（見表3、4）。

2.3 卵母細胞成熟過程中OCT-4、GLUT1、IFNT、GHSR-1a、和GAPDH基因相對表達量 對照組（見圖2）：卵母細胞成熟過程中，OCT-4在GV期、GVBD期、MI期、MII期相對表達量未見明顯變化，在IVM過程中基本維持不變；GLUT1的相對表達量在GVBD期降低，MI期、MII期持續(xù)增加，MII期GLUT1的相對表達量達到最大，為初始相對表達量的1.4倍；IFNT在GVBD期、MI期、MII期表達量不斷增加，GVBD期IFNT的表達量為初始量的1.69倍，MI期為初始量的1.4倍，MII期達到最大，為初始量的1.75倍；Ghrelin受體GHSR-1a的相對表達量在IVM過程中呈緩慢遞減趨勢變化，Ghrelin受體GHSR-1a在MII期相對表達量遞減趨勢明顯，為初始相對表達量的-0.2倍。實驗組（見圖3）：卵母細胞成熟過程中，Ghrelin受體GHSR-1a基因和卵母細胞質(zhì)量相關(guān)基因OCT4、GLUT-1和IFNT隨著卵母細胞成熟過程的表達動態(tài)。其中OCT-4在GV期、GVBD期、MI期、MII期相對表達量未見明顯變化，GVBD期的相對表達量達到最高為初始表達量的1.2倍，OCT-4的相對表達量在IVM過程中基本維持不變；GLUT1的相對表達量在GV期、GVBD期，MI期、MII期持續(xù)快速增加，MII期GLUT1的相對表達量達到最大，為初始相對表達量的1.26倍；IFNT在GVBD期、MI期、MII期表達量不斷增加，GVBD期IFNT的表達量為初始量的1.29倍，MI期為初始量的1.43倍，MII期達到最大，為初始量的1.90倍；Ghrelin受體GHSR-1a的相對表達量隨著IVM時間的推進呈下降趨勢變化，當?shù)竭_MII期時Ghrelin受體GHSR-1a相對表達量到達相對表達量的最低點，為初始量的0.315倍。結(jié)果說明（見圖2、圖3）：在實驗組并沒有影響卵母細胞Ghrelin受體GHSR-1a基因和卵母細胞質(zhì)量相關(guān)基因OCT4、GLUT-1和IFNT的表達水平，僅提前表達了相關(guān)基因的表達；GV期：實驗組GHSR-1a基因相對表達量較對照組而言差異顯著（p<0.05）、GVBD期：實驗組GHSR-1a基因相對表達量較對照組差異極顯著（p<0.01）、MII期：實驗組GLUT1基因相對表達量較對照組差異顯著（p<0.05）。

3 討論

本研究證實添加Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟具有促進作用，這與白瑞霞等[7]的研究結(jié)果相吻合，但對于Ghrelin的適宜添加量，各種報道中有所不同。本研究結(jié)果顯示，添加200ng/mL的Ghrelin培養(yǎng)條件可獲得理想的成熟效果，而王正光等[8]的研究則認為添加50ng/mL Ghrelin培養(yǎng)條件對卵母細胞的成熟及后續(xù)的胚胎發(fā)育最為合適的，這可能與不同實驗室采用的培養(yǎng)體系有所不同有關(guān)。本研究就外源添加一定濃度Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的影響進行探索研究，以期為胚胎生產(chǎn)及細胞工程的基礎(chǔ)研究進一步奠定一定的理論基礎(chǔ)。

GHSR-1a是Ghrelin的一個受體亞型[9]，它的分布十分廣泛，在多種分泌作用中發(fā)揮作用[10]。Ghrelin的生物學作用是通過與GHSR-1a受體特異性結(jié)合而實現(xiàn)得。與以前報道的研究結(jié)果一致[11]，本研究經(jīng)過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)Ghrelin受體GHSR-1a在體外成熟培養(yǎng)條件下，其相對表達量均隨著成熟進程的發(fā)育而減弱直到MII期達到最小，在添加Ghrelin后，GHSR-1a的表達提前了。這可能是由于添加外源Ghrelin后，刺激了Ghrelin受體GHSR-1a的表達，二者通過結(jié)合產(chǎn)生作用。而當卵母細胞成熟完成后，Ghrelin完成了對卵母細胞成熟的調(diào)節(jié)，或者是Ghrelin被消耗，而致使其受體的表達量也下降。這些都表明Ghrelin通過調(diào)節(jié)受體GHSR-1a的表達而參與了綿羊卵母細胞的體外成熟過程。

在早期胚胎發(fā)育過程中，Pit-oct-unc轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT-4的表達是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵[12]，不僅如此，卵母細胞母源OCT-4的mRNA水平也是卵母細胞進一步發(fā)育所必不可少的[13]。也就是說，卵母細胞OCT-4的mRNA水平發(fā)生改變，會影響到卵母細胞的進一步發(fā)育。我們的研究發(fā)現(xiàn)成熟液中添加Ghrelin對母系來源的OCT-4沒有影響。這表明添加Ghrelin，在提高綿羊卵母細胞體外成熟率的同時，不影響卵母細胞的質(zhì)量，也不影響其后的進一步發(fā)育。

有研究發(fā)現(xiàn)GLUT1，一類協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超級家族的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白[14]，參與了卵母細胞和早期胚胎的代謝[15]。GLUT1影響卵母細胞的成熟和植入前胚胎的發(fā)育[16]，而且GLUT1的表達量和綿羊卵母細胞發(fā)育能力呈正相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞體外成熟液中添加Ghrelin可以顯著提高綿羊卵母細胞的成熟率，縮短卵母細胞成熟時間，期間GLUT1的表達也隨著卵母細胞成熟進程的加快而提前。這可能是GLUT1通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的作用，參與了卵母細胞的成熟調(diào)節(jié)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin除了調(diào)節(jié)GLUT1基因的提前表達參與卵母細胞體外成熟外，也參與了IFNT基因表達的調(diào)節(jié)。IFNT基因是卵丘細胞的標記基因之一，在早期胚胎的表達有助于胚胎的植入識別[19]。

已有研究表明：IFNT最初是在綿羊孕體條件培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的[20]，參與多種功能的調(diào)節(jié)[21]。IFNT還與卵母細胞發(fā)育潛能相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)：IFNT和GLUT1基因的表達調(diào)節(jié)一樣，Ghrelin通過調(diào)節(jié)IFNT基因的提前表達參與卵母細胞體外成熟，但不改變IFNT基因在卵母細胞成熟進程中的動態(tài)表達變化，從而維持卵母細胞提前成熟，而不改變其質(zhì)量和進一步發(fā)育的能力。本研究通過比較發(fā)現(xiàn)不同濃度的Ghrelin對綿羊卵母細胞體外成熟有不同影響，一定濃度Ghrelin能顯著提高卵母細胞的成熟率。在綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加一定濃度Ghrelin，綿羊卵母細胞的成熟時間縮短。這些結(jié)果表明，Ghrelin介導了綿羊卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)，這可能是由于Ghrelin能促進綿羊卵母細胞的代謝，從而加快了卵母細胞的成熟。本試驗為后續(xù)進一步研究外源Ghrelin對綿羊卵母細胞成熟機制及作用提供了基礎(chǔ)，但詳細的機制還有待進一步研究。

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（責編：張宏民）