聶忠莉，楊　慧，王曉玲，黃金玉，張　勇，蕭茂玲

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都　610106；2.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都　610041)

0　引　言

阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片，是由阿莫西林三水合物和克拉維酸鉀組成的復(fù)方制劑，阿莫西林為殺菌性廣譜抗生素，克拉維酸鉀為不可逆的廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，其可有效抑制耐藥菌產(chǎn)生，使已對阿莫西林耐藥并產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細菌仍然對阿莫西林敏感[1].阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片臨床上用于因β-內(nèi)酰胺酶流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌所致的下呼吸道感染、中耳炎、鼻竇炎的治療，以及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶金葡菌和產(chǎn)酶腸桿菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬所致的尿路和皮膚軟組織抗感染等[2].目前，阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片注冊標準中沒有有關(guān)物質(zhì)檢查項，對此，本研究為了更好地控制其質(zhì)量，參照阿莫西林克拉維酸鉀片質(zhì)量標準[3]中有關(guān)物質(zhì)的測定方法，利用高效液相色譜法迅速、準確、靈敏度高與專屬性強的特點[4-5]對阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關(guān)物質(zhì)進行測量.

1　材料與儀器

1.1　材　料

實驗所用材料包括：阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片(批號，161001、161002、161003)，由四川制藥制劑有限公司生產(chǎn)；雜質(zhì)D(批號，56293，純度≥92.3%)、雜質(zhì)J(批號，R064U0，混合物)、雜質(zhì)C(批號，39563，純度≥96.3%)，由LGC公司生產(chǎn)；阿莫西林對照品(批號，130409-201512，純度≥86.9%)、克拉維酸對照品(批號，130409-201307，純度≥95.0%)、阿莫西林克位維酸系統(tǒng)適用性實驗對照品(批號，130588-201202)，由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純、磷酸二氫鉀為分析純，由成都科龍化工試劑廠生產(chǎn).

1.2　儀　器

實驗所用儀器包括：5410/L-2455型高效液相色譜儀(Hitachi公司)；BP-210D型電子天平(Sartorius公司)，pHS-3C型酸度計(上海佑科儀器儀表有限公司).

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

實驗色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相A為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)，流動相B為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)—乙腈(20∶80)，檢測波長為230 nm；先以流動相A—流動相B(98∶2)等度洗脫，待阿莫西林洗脫完畢后立即按表1流程進行線性梯度洗脫.

表1　梯度洗脫程序表

2.2　溶液配制

2.2.1供試品溶液配制.

取本品的細粉適量，加流動相A溶解(必要時冰浴超聲5～10 min助溶)并稀釋制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S計)2 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

2.2.2對照溶液配制.

精密量取供試液適量，用流動相A定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S計)40 μg的溶液，作為對照溶液.

2.3　系統(tǒng)適用性及雜質(zhì)定位

精密稱取阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性實驗對照品，加入流動相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林2.5 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性對照品溶液，取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次.結(jié)果見表2、3及圖1、2.

表2　阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性實驗峰面積結(jié)果

表3　阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性實驗峰保留時間結(jié)果(min)

精密稱取雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)J對照品適量，分別加入流動相A溶解并稀釋制成每1 mL含上述雜質(zhì)1 mg的儲備液.精密量取儲備液適量，分別加流動相A稀釋制成每1 mL含上述雜質(zhì)0.1 mg的定位溶液，各取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見表4.

實驗數(shù)據(jù)顯示，記錄的色譜圖與標準圖譜一致，且阿莫西林、克拉維酸及各雜質(zhì)主峰峰面積的RSD%小于2.0%、保留時間RSD%小于1.0%，定位溶液的主峰與系統(tǒng)圖譜中相應(yīng)雜質(zhì)峰的保留時間一致.結(jié)果表明，該色譜條件下的系統(tǒng)適用性良好.

圖1阿莫西林克拉維酸制劑有關(guān)物質(zhì)用標準譜圖

圖2阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性對照品溶液圖譜

表4　定位實驗結(jié)果

2.4　專屬性實驗

取本品(批號，161001)10片，精密稱定，研細，分別精密稱取細粉適量，再進行強酸、強堿、氧化、高溫和光照破壞性實驗.分別精密量取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表5及圖3.

表5　阿莫西林克拉維酸有關(guān)物質(zhì)專屬性實驗結(jié)果

從表5和圖3可知：空白溶劑和空白輔料無干擾；在各破壞條件下，阿莫西林峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5，克拉維酸峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度雖小于1.5，但與阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性圖譜一致；降解平衡在90%～100%之間.因此，在本條件下系統(tǒng)專屬性良好.

圖3未破壞樣品HPLC圖譜

2.5　檢測限與定量限確定

取阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D對照品適量，加入流動相A溶解并稀釋制成每1 mL含阿莫西林2 mg、克拉維酸鉀0.3 mg、雜質(zhì)C 0.1 mg、雜質(zhì)D 0.1 mg的儲備液.精密量取各儲備液適量，加流動相A稀釋制成一定濃度的溶液，取此溶液20 μL進樣，記錄色譜圖，計算信噪比，以信噪比約3∶1為檢測限，以信噪比約10∶1為定量限.檢測結(jié)果為：阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D檢測限分別是0.06 μg、0.012 μg、0.06 μg與0.013 μg；定量限分別是0.55 μg、0.04 μg、0.551 μg與0.062 μg.

2.6　線性范圍考察

取“2.5”項下阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D儲備液適量，置同一量瓶中分別用流動相A稀釋至適宜的濃度，作為線性供試品溶液，分別精密量取各線性溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做標準曲線.結(jié)果顯示：阿莫西林雜質(zhì)C在濃度為0.11～105.74 μg/mL范圍內(nèi)，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=39.335x+4.4896，R2=0.9999；阿莫西林雜質(zhì)D在濃度為0.10～97.38 μg/mL范圍內(nèi)，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=30.0364x+5.9779，R2=0.9999；阿莫西林在濃度為0.11～105.15 μg/mL范圍內(nèi)，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=30.0343x+4.8544，R2=0.9999；克拉維酸在濃度為0.10～101.94 μg/mL范圍內(nèi)，進樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=23.5674x+5.0952，R2=0.9999.

2.7　準確度實驗

精密稱取研細后的本品細粉各65.7 mg，共10份，置于10 mL量瓶中.1～3號精密加入雜質(zhì)儲備液(含雜質(zhì)C 0.1 mg/mL、雜質(zhì)D 0.2 mg/ml)0.5 mL，作為50%的供試品樣；4～6號精密加入雜質(zhì)儲備液(含雜質(zhì)C 0.1 mg/mL、雜質(zhì)D 0.2 mg/mL)1 mL，作為100%的供試品樣；7～9號精密加入雜質(zhì)儲備液(含雜質(zhì)C 0.1 mg/mL、雜質(zhì)D 0.2 mg/mL)1.5 mL，作為150%的供試品樣；10號作為未加雜質(zhì)的供試品樣.分別向1～10號加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

取雜質(zhì)儲備液適量，加入流動相A稀釋制成每1 mL中約含雜質(zhì)C 0.01 mg、雜質(zhì)D 0.02 mg的溶液，作為對照品溶液；另精密量取各供試品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述對照溶液、對照品溶液和供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀分別測定.分別按外標法、自身對照法計算各雜質(zhì)含量.結(jié)果顯示：采用自身對照法測定咀嚼片中阿莫西林雜質(zhì)C的平均回收率為121.28%，RSD為2.9%，雜質(zhì)D的平均回收率為94.98%，RSD為4.3%，回收率不符合要求；采用外標法測定咀嚼片中阿莫西林雜質(zhì)C的平均回收率為98.72%，RSD為2.4%，雜質(zhì)D的平均回收率為96.98%，RSD為2.4%，各雜質(zhì)的回收率均在90%～100%之間，RSD小于5.0%，回收率良好，準確度符合要求.

從兩種方法測定的雜質(zhì)含量的數(shù)據(jù)可看出，自身對照法測定的雜質(zhì)含量值均大于或相當于外標法測定的雜質(zhì)含量值.因此，采用自身對照法測定雜質(zhì)含量，仍能很好地控制本品中的雜質(zhì)限度，其方法是可行的.

2.8　精密度實驗

2.8.1重復(fù)性實驗.

精密稱取研細后的本品細粉各65 mg共6份，分別加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.另精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述對照溶液和供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀分別測定，分別按自身對照法計算各雜質(zhì)含量，6份樣品測定含量基本一致，RSD%均小于10.0，說明重復(fù)性良好.

2.8.2進樣精密度實驗.

精密稱取研細后的本品細粉66.66 mg，加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述對照溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，對照溶液6次連續(xù)進樣各成分峰面積RSD%均小于1.0，說明進樣精密度良好.

2.8.3中間精密度實驗.

由不同分析人員在不同時間、不同儀器上取重復(fù)性實驗項下細粉6份，同法測定.結(jié)果顯示，同一樣品由不同人員在不同時間、不同儀器上重復(fù)測定12次，RSD%的含量均小于20.0，說明中間精密度良好.

2.9　穩(wěn)定性實驗

精密稱取研細后的本品細粉64.17 mg，加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.分別在0、2、4、6、8 h取供試品溶液及對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按自身對照法計算各雜質(zhì)含量.結(jié)果顯示：同一樣品，對照溶液分別在0、2、4、6、8 h內(nèi)連續(xù)進樣，各雜質(zhì)和主峰面積均無明顯變化，峰面積RSD均小于1.0%，對照溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定；供試品溶液雜質(zhì)含量隨時間推移在不斷增加，但在2 h內(nèi)變化較小，8 h內(nèi)雖然增加，但在仍標準規(guī)定的范圍內(nèi).因此，對本品有關(guān)物質(zhì)的測定最好在樣品配制2 h內(nèi)進樣.

2.10　耐用性實驗

精密稱取研細后的本品細粉66.11 mg，加流動相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動相A至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

取上述供試品和對照溶液和空白溶劑，按表6相關(guān)數(shù)據(jù)改變流動相流速、pH值與不同色譜柱等因素來考察變動因素對含量測定的影響，結(jié)果如表6所示.

表6　阿莫西林有關(guān)物質(zhì)耐用性實驗結(jié)果(%)

表6數(shù)據(jù)顯示，當在流動相流速與pH值發(fā)生微小變化，以及更換不同品牌的色譜柱的情況下，測定樣品中各雜質(zhì)含量以及各成分峰之間的分離度與原條件變化不大.此表明本方法的耐用性良好.

2.11　樣品中有關(guān)物質(zhì)測定

按驗證后符合要求的方法，分別對3批樣品進行了檢測，并分別以對照溶液中的2個主峰面積和以及阿莫西林峰計算各雜質(zhì)的含量，結(jié)果如表7、8所示.

表7　3批樣品有關(guān)物質(zhì)各雜質(zhì)含量(%)測定結(jié)果

表8　3批樣品有關(guān)物質(zhì)各雜質(zhì)含量(%)測定結(jié)果

表7、8數(shù)據(jù)表明，阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果3批樣品均符合規(guī)定.

3　結(jié)　論

本研究通過高效液相色譜法測定阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗證實驗表明：采用自身對照法測定雜質(zhì)含量，能很好地控制本品中的雜質(zhì)限度，即采用自身對照法測定本品雜質(zhì)含量的方法是可行的.