王 玲,秦會(huì)安,侯婷婷,李 倩

(鄭州師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,河南鄭州 450044)

色氨酸(tryptophan,Trp)是人體必需氨基酸之一,具有調(diào)節(jié)蛋白合成,促進(jìn)人體免疫消化的功能,其代謝異常會(huì)引起神經(jīng)功能障礙。人和動(dòng)物自身不能合成色氨酸,需要通過食物獲取,因此,色氨酸被廣泛應(yīng)用于食品、飼料以及醫(yī)療行業(yè)。規(guī)范及檢測市場產(chǎn)品中色氨酸的含量是一項(xiàng)重要的工作,建立色氨酸測定方法具有重要意義。目前測定色氨酸的方法主要有熒光光譜法[1]、高效液相色譜法[2]、分光光度法[3]和毛細(xì)管電泳[4]等技術(shù)。電化學(xué)方法與上述方法相比,具有快捷、靈敏,檢測成本低的優(yōu)點(diǎn)。但是,色氨酸在傳統(tǒng)電極上的電化學(xué)氧化有較高的過電位[5],直接測定靈敏度不高。另外,酪氨酸與多個(gè)氨基酸在很多發(fā)酵產(chǎn)物中同時(shí)存在,氧化電位與色氨酸幾乎重疊,傳統(tǒng)電極無法選擇性檢測色氨酸。許多新材料修飾的電極被應(yīng)用于色氨酸的測定[5-11]。但是在實(shí)際樣品中,直接實(shí)現(xiàn)高靈敏、高選擇性的測定色氨酸仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

氨基酸由于含有氨基和羧基兩種官能團(tuán),具有許多優(yōu)良的特性,常被用作電極修飾材料。L-半胱氨酸(L-cys)是常見的20種天然氨基酸之一,具有良好的電化學(xué)活性,在電極表面聚合形成的高分子膜具有良好的催化功能和生物兼容性。Nafion膜是一種全氟磺化聚合物,具有較強(qiáng)的成膜性,在電極表面形成的高分子膜對電極具有較好的保護(hù)作用,被廣泛用作電極修飾劑應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域[12]。目前Nafion/L-cys/GCE用于色氨酸的檢測還未見有報(bào)道。

本文通過電聚合和滴涂方式將半胱氨酸和Nafion共修飾于玻碳電極(GCE)上,制備了Nafion-聚半胱氨酸修飾電極(Nafion/L-cys/GCE)。該修飾電極對色氨酸電化學(xué)反應(yīng)具有較強(qiáng)的催化作用,據(jù)此建立了靈敏檢測色氨酸含量的新方法。與目前報(bào)導(dǎo)的色氨酸電化學(xué)檢測方法相比,該修飾電極制備過程簡便,靈敏度高,為色氨酸定量分析提供了方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

色氨酸和L-半胱氨酸 阿拉丁試劑(上海)有限公司;Nation 上海河森電器有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、氫氧化鈉、精氨酸,賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、檸檬酸、抗壞血酸等 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;香蕉 某百貨超市;水 超純水。

RST5000電化學(xué)工作站 蘇州瑞斯特儀器有限公司;pHS-3D酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司;81-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;艾科蒲ABW-0501-U高純水機(jī) 長沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司;BS224S 電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司;H1850離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;BCD-218EMG3C新飛冰箱 河南新飛電器集團(tuán)有限公司;三電極體系(玻碳電極、甘汞電極和鉑柱電極) 武漢高仕瑞聯(lián)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Nafion/L-cys/GCE的構(gòu)筑 修飾之前,玻碳電極先在附有0.03 μm Al2O3拋光粉的麂皮上拋光,然后依次在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗干凈,取出電極,吹干。將該電極置于L-cys溶液中(0.1 mol/L pH7.0 PBS緩沖溶液配制),在-0.6～2.5 V電位窗口范圍內(nèi)以0.1 V/s循環(huán)伏安掃描10圈[13]。取出,超純水清洗表面,紅外燈下烤干,得L-cys/GCE。微量進(jìn)樣器移取8 μL 0.1% Nafion(無水乙醇)溶液滴涂在L-cys/GCE表面得Nafion/L-cys/GCE,晾干待用。

1.2.2 修飾電極制備條件優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)條件研究中,除特殊說明外,電位范圍為0.25～0.9 V,掃速為0.1 V/s。制備的Nafion/L-cys/GCE為工作電極,鉑柱電極為輔助電極,甘汞電極為參比電極,PBS緩沖溶液(pH6)作為支持電解質(zhì),攪拌富集2 min,采用循環(huán)伏安法研究不同修飾條件對2.0×10-5mol/L的色氨酸溶液峰電流的影響。

半胱氨酸溶液濃度的影響:聚合圈數(shù)為10,Nafion滴涂量8 μL,改變半胱氨酸濃度分別為1.0×10-2、1.0×10-3mol/L,利用制備的修飾電極循環(huán)伏安法測定2.0×10-5mol/L的色氨酸溶液。色氨酸氧化峰電流最大時(shí),半胱氨酸濃度為最佳。

聚合圈數(shù)的影響:半胱氨酸濃度固定為1.0×10-2mol/L,Nafion滴涂量8 μL,改變聚合圈數(shù)分別為5、10、15、20,利用制備的修飾電極測定2.0×10-5mol/L的色氨酸溶液。色氨酸氧化峰電流最大時(shí),聚合圈數(shù)為最佳。

1.2.3 色氨酸測定條件及電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理研究方法 支持電解質(zhì)pH的影響:將Nafion/L-cys/GCE置于含有色氨酸的PBS溶液中,攪拌富集2 min,改變?nèi)芤簆H(4、5、6、7、8),以0.1 V/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。色氨酸峰電流最大時(shí)介質(zhì)的酸度選為測定的最佳酸度,并以氧化峰電位Epa(V)對pH作圖,研究色氨酸在修飾電極上的反應(yīng)機(jī)理。

掃描速度的影響:Nafion/L-cys/GCE置于含有色氨酸的PBS(pH6)溶液中,攪拌富集2 min,改變掃描速(0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20、0.25 V/s)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。以氧化峰電流Ipa(μA)與掃描速度v(V/s)作圖,研究反應(yīng)機(jī)理。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,將Nafion/L-cys/GCE置于不同濃度的色氨酸的PBS溶液中(0、0.4×10-6、0.8×10-6、2.0×10-6、4.0×10-6,10.0×10-6,20.0×10-6,40.0×10-6mol/L),攪拌富集2 min,以0.1 V/s的掃描速度進(jìn)行線性伏安掃描。以氧化峰電流Ipa(μA)對色氨酸濃度c作圖,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.5 樣品處理及測定方法 取新鮮香蕉,去皮后研缽研成糊,用分析天平準(zhǔn)確稱取約10 g,置于錐形瓶中,加入100 mL PBS緩沖溶液(pH6),振蕩6 h,轉(zhuǎn)速6000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶,用PBS緩沖溶液定容,冷藏備用。

Nafion/L-cys/GCE置于5 mL待測樣品中,攪拌富集2 min,以0.1 V/s的掃描速度進(jìn)行線性伏安掃描,記錄峰電流并進(jìn)行加標(biāo)回收,計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nafion/L-cys/GCE制備過程優(yōu)化

不同濃度半胱氨酸溶液對色氨酸峰電流的影響如圖1所示。結(jié)果表明,半胱氨酸濃度為1.0×10-2mol/L時(shí),色氨酸氧化峰電流響應(yīng)較大,故選用1.0×10-2mol/L半胱氨酸進(jìn)行電化學(xué)聚合。

圖1 半胱氨酸濃度對2.0×10-5 mol/L色氨酸峰電流的影響Fig.1 The effect of L-cys concentration on the peak currents of Trp注:a為1.0×10-2,b為1.0×10-3 mol/L。

修飾膜的厚度會(huì)影響電極表面性質(zhì)和功能,聚合圈數(shù)直接影響膜的厚度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2),當(dāng)聚合圈數(shù)從5增加到10時(shí),色氨酸峰電流逐漸增加;超過10圈以后,峰電流反而降低。原因可能是,開始圈數(shù)增加,電極表面反應(yīng)位點(diǎn)增加,電子傳送能力較強(qiáng),峰電流逐漸增加。當(dāng)聚合圈數(shù)達(dá)到某一個(gè)值時(shí)(10圈),修飾膜太厚,逐漸阻礙了電子及色氨酸與電極表面間的傳輸,色氨酸峰電流降低。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇聚合圈數(shù)為10圈。

圖2 聚合圈數(shù)對色氨酸峰電流的影響Fig.2 The effect of circle number on the peak currents of Trp

2.2 色氨酸在不同電極上的電化學(xué)行為

研究色氨酸在不同電極上的電化學(xué)行為如圖3所示,Nafion/L-cys/GCE在空白溶液中無氧化還原峰,而在色氨酸溶液中,于0.7 V處出現(xiàn)一強(qiáng)氧化峰。同樣實(shí)驗(yàn)條件下,GCE對色氨酸溶液幾乎沒有電化學(xué)響應(yīng),說明Nafion/L-cys/GCE對色氨酸具有較強(qiáng)電催化作用。Nafion/L-cys/GCE反向掃描時(shí),無還原峰出現(xiàn),表明色氨酸在該修飾電極上是不可逆的電化學(xué)氧化過程。

圖3 不同電極循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of the different electrodes 注:a. Nafion/L-cys/GCE在色氨酸溶液中的循環(huán)伏安圖;b. Nafion/L-cys/GCE在空白溶液中的循環(huán)伏安圖;c. GCE(a)在色氨酸溶液中的循環(huán)伏安圖。

2.3 色氨酸測定條件及電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理探索

不同pH對色氨酸電化學(xué)行為研究結(jié)果如圖4。據(jù)圖看出,當(dāng)pH為6.0時(shí)色氨酸的峰形較好,背景電流相對較低,且接近人體酸度,因此,選用pH6.0作為測定的介質(zhì)酸度。另外,色氨酸峰電位隨pH增大而負(fù)移,判斷質(zhì)子參與了色氨酸電氧化過程[14],以氧化峰電位Epa(V)對pH作圖,得Epa(V)=1.01-0.05pH(R2=0.9952),方程的斜率與理論值0.059 V/pH相近,說明參加色氨酸在Nafion/L-cys/GCE上的電極反應(yīng)是一個(gè)等質(zhì)子等電子的電極反應(yīng)過程。

圖4 色氨酸在Nafion/L-cys/GCE 上不同pH溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of the Nafion/L-cys/GCE in Trp solution in different pH

不同掃描速度下,色氨酸的電化學(xué)響應(yīng)研究如圖5。由圖看出,峰電流隨著掃描速度增大而增大,掃描速度過大時(shí),背景電流也較強(qiáng),穩(wěn)定性較差,掃速為0.1 V/s時(shí),具有較高的氧化峰電流且穩(wěn)定性較好。因此,確定0.1 V/s作為最佳掃速。另外,氧化峰電流與掃速之間成線性關(guān)系,回歸方程為Ipa(μA)=11.3 v(V/s)+0.61(R2=0.9683)。電流與掃描速率呈線性關(guān)系,說明色氨酸在Nafion/L-cys/GCE上電極反應(yīng)是一個(gè)受吸附控制的電化學(xué)氧化過程[15]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,利用線性掃描伏安法對不同濃度的色氨酸進(jìn)行定量分析,線性掃描伏安圖如圖6。隨著色氨酸濃度增大,峰電流逐漸增大,在0.4×10-6～40.0×10-6mol/L的濃度范圍內(nèi),峰電流與濃度有良好的線性關(guān)系。以峰電流對色氨酸濃度作圖(圖7),回歸方程為Ipa(μA)=0.6997c(10-6mol/L)+5.3(R2=0.9844),檢測限為1.0×10-8mol/L(S/N=3)。將Nafion/L-cys/GCE與其他測定色氨酸的電化學(xué)傳感性能進(jìn)行對比,結(jié)果如表1。對比發(fā)現(xiàn),本研究中構(gòu)筑的Nafion/L-cys/GCE,不僅方法簡單,且具有更低的檢測限,檢測靈敏度高。

表1 不同修飾電極性能比較Table 1 Comparison of the analytical performances of different modified electrode

圖6 不同濃度的色氨酸線性掃描伏安圖Fig.6 Linear sweep voltammograms of different concentration of Trp注:a～h濃度分別為 0、0.4×10-6、0.8×10-6、2.0×10-6、 4.0×10-6、10.0×10-6、20.0×10-6、40.0×10-6 mol/L。

圖7 峰電流與色氨酸濃度校準(zhǔn)曲線圖Fig.7 The calibration curve was the peak current vs the concentration of Trp

2.5 選擇性及重現(xiàn)性考察

為了考察Nafion/L-cys/GCE的重現(xiàn)性,制備4支Nafion/L-cys/GCE,置于2.0×10-5mol/L色氨酸溶液,測定峰電流,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%,表明Nafion/L-cys/GCE修飾電極具有較好的重現(xiàn)性。

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,考察了常見氨基酸及化合物對測定的干擾。色氨酸濃度為定為2.0×10-5mol/L,允許測定的相對誤差為<±5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,100倍的賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、L-半胱氨酸對色氨酸測定無干擾。500倍的NaNO3、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、葡萄糖、200倍的檸檬酸、抗壞血酸對色氨酸的氧化峰電流無明顯干擾。因此,該修飾電極對色氨酸有良好的選擇性,可以應(yīng)用到實(shí)際樣品測定。

2.6 實(shí)際樣品測定

為了驗(yàn)證本工作中構(gòu)筑的修飾電極的可行性,利用線性掃描伏安法對香蕉中的色氨酸含量進(jìn)行了測定。被測樣品中沒有檢測出色氨酸,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收測定實(shí)驗(yàn)。由表2結(jié)果可以看出,回收率在95%～98%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.0%,因此本研究所建立的方法可以用于香蕉中色氨酸含量的測定。

表2 香蕉中色氨酸含量測定(n=5)Table 2 The determination for Trp in banana

3 結(jié)論

本研究構(gòu)筑了聚半胱氨酸和Nafion修飾的玻碳電極;該修飾電極對色氨酸電化學(xué)氧化具有強(qiáng)的電催化作用,基于此建立了靈敏檢測色氨酸含量的電化學(xué)方法。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,色氨酸濃度在0.4×10-6～40.0×10-6mol/L范圍內(nèi)與氧化峰電流有良好線性關(guān)系,最低檢出限為1.0×10-7mol/L。該方法為食品中色氨酸含量的測定提供了方法參考。