賽那 金蓉 布仁 顧艷麗 林英華 雷雯樸 孫耀

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）06-0761-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.10

摘 要 目的：建立高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法快速測(cè)定大鼠血漿中的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的方法。方法：血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)氫溴酸高烏甲素，以甲醇沉淀蛋白進(jìn)行預(yù)處理。采用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法進(jìn)行樣品測(cè)定，色譜柱為Sinochrom ODS-BP C18，流動(dòng)相為乙腈-1%甲酸水溶液（50 ∶ 50，V/V），流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為25 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃；質(zhì)譜掃描模式為全離子監(jiān)測(cè)模式，正離子采集，設(shè)定檢測(cè)離子質(zhì)荷比（m/z）分別為646.32（烏頭堿）、632.30（新烏頭堿）、616.31（次烏頭堿）、604.31（苯甲酰烏頭原堿）、590.29（苯甲酰新烏頭原堿）、574.30（苯甲酰次烏頭原堿）、585.31（內(nèi)標(biāo)）。取雄性Wistar大鼠6只，單劑量灌胃附子總生物堿提取物（4 mg/kg），分別于給藥前（0 h）和給藥后0.5、0.75、1.25、1.5、2、4、6、8、10、24 h時(shí)取血，測(cè)定血漿藥物濃度并以PK-Solver V2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：血漿中6種附子生物堿質(zhì)量濃度均在0.1～10 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0.992），定量限均為0.1 μg/L；平均提取回收率均大于75%，日內(nèi)精密度、日間精密度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于15%。大鼠血漿中6種附子生物堿的tmax均分別為1.2 h左右，t1/2均分別為10 h左右，單酯型烏頭原堿的cmax均分別高于雙酯型烏頭堿。結(jié)論：本研究所建立的高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，可用于6種附子生物堿的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法；附子生物堿；血藥濃度；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry for rapid determination of aconitine， mesaconitine， hypaconitine， benzoylaconitine， benzoylmesaconine and benzoylhypacoitine in rat plasma. METHODS： Internal standard lappaconitine was added into plasma sample， and methanol precipitated protein was used for pretreatment. HPLC-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry was adopted. HPLC condition was as follows as Sinochrom ODS-BP C18 column， mobile phase consisted of acetonitrile-1% formic acid solution （50 ∶ 50，V/V）， the flow rate of 0.6 mL/min， sample size of 10 μL， column temperature of 25 ℃， automatic sampler temperature of 4 ℃. Mass spectrum scanning mode was full ion monitoring model， positive ion acquisition， mass charge ratios （m/z） of ion were 646.32（aconitine）， 632.30（mesaconitine），616.31（hypaconitine），604.31（benzoylaconitine），590.29 （benzoylmesaconine），574.30（benzoylhypacoitine）， 585.31 （internal standard）. Six male Wistar rats were collected and given single dose of total alkaloid extract of Aconitum carmichaeli （4 mg/kg）intragastrically. Blood samples were collected before medication （0 h） and 0.5， 0.75， 1.25， 1.5， 2， 4， 6， 8， 10， 24 h after medication. Plasma concentration was determined and pharmacokinetic parameters were calculated by using PK-Solver V2.0 software. RESULTS：The linear range of 6 kinds of aconitum alkaloids in plasma were 0.1-10 μg/L （r>0.992）. The limit of quantitation was 0.1 μg/L. Average recovery was higher than 75%， RSDs of intra-day and inter-day， matrix effects， stability test were all lower than 15%. The tmax of 6 kinds of aconite alkaloids were about 1.2 h； t1/2 were about 10 h； cmax of monoestertype aconite alkaloids were higher than those of diester-type aconite alkaloids. CONCLUSIONS： Established HPLC-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry is accurate， sensitive， simple and rapid， and can be used for plasma concentration monitoring of 6 kinds of aconitum alkaloids.

KEYWORDS HPLC； Quadrurpole/electrostatic field orbitrap mass spectrometry； Aconitum alkaloids； Plasma concentration； Rats

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭的子根，味辛、甘，性大熱，有大毒，歸心、脾、腎經(jīng)，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、強(qiáng)心等藥理作用[1]。附子中含有烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等生物堿，此類生物堿具有較強(qiáng)的藥理活性，同時(shí)也是附子的毒性成分[2-3]。附子引起的毒性反應(yīng)發(fā)病急、進(jìn)展快，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常并發(fā)心肌損害等，從而威脅患者生命安全。因此，建立血漿中附子藥理活性/毒性成分的檢測(cè)方法，對(duì)快速診斷附子臨床中毒具有重要意義。目前，關(guān)于液相色譜（LC）-質(zhì)譜（MS）法同時(shí)測(cè)定生物樣品中6種主要的附子生物堿的方法已有報(bào)道，但大多具有操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的缺點(diǎn)，不利于大批量生物樣品分析。

四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀是近幾年發(fā)展起來的一種新型的質(zhì)譜分析儀器，具有定量分析能力強(qiáng)、分辨率高、分析速度快、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，目前已被廣泛用于中藥安全控制、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和藥品研發(fā)中化合物結(jié)構(gòu)鑒定[4-5]。本研究建立了高效液相色譜（HPLC）-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法快速檢測(cè)大鼠血漿中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等6種附子生物堿含量的測(cè)定方法，為附子中毒的臨床診斷及其藥動(dòng)學(xué)、毒動(dòng)學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000快速超高效液相色譜儀（含雙三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、進(jìn)樣恒溫箱）、Q Exactive 組合型四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（含電噴霧離子源、Analyst QS2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）均為美國(guó)Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；G-560E液體快速混勻機(jī)（美國(guó)Scientific Industries公司）；AB135-S精密分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110797-201108）、新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110798-201307）、次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110799-201107）、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：111794-201303）、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：111795-201002）、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)：111796-201303）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（純度：均大于98%）；氫溴酸高烏甲素（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：20160407，上海源葉生物科技有限公司，純度：>98%）；附子總生物堿提取物（批號(hào)：20170104，赤峰艾克制藥股份有限公司）；肝素鈉注射液（批號(hào)：20170604，天津生化制藥有限責(zé)任公司）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量270～320 g，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蒙）2015-0001，使用許可證號(hào)：SYXK（蒙）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-1%甲酸水溶液（50 ∶ 50，V/V）；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：2 kV；離子傳輸管溫度：200 ℃；鞘氣：30 arb；輔助氣：2 arb；掃描模式：全離子監(jiān)測(cè)模式，正離子采集；一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000。設(shè)定檢測(cè)離子質(zhì)荷比（m/z）：585.31（內(nèi)標(biāo)）、646.32（烏頭堿）、632.30（新烏頭堿）、616.31（次烏頭堿）、604.31（苯甲酰烏頭原堿）、590.29（苯甲酰新烏頭原堿）、574.30（苯甲酰次烏頭原堿）。上述各待測(cè)成分的質(zhì)子化分子離子（[M+H]+）圖譜見圖1。

2.3 血漿樣品處理方法

取血漿200 μL，加入240 μg/L的氫溴酸高烏甲素的甲醇溶液（內(nèi)標(biāo)溶液）20 μL，渦旋混勻30 s后，準(zhǔn)確加入甲醇1 mL沉淀蛋白，渦旋6 min，12 000 r/min（離心半徑9 cm，下同）離心10 min；然后取上清液700 μL于尖底離心管中，37 ℃下氮?dú)獯蹈桑?20 ℃冷凍備用。測(cè)定前加入流動(dòng)相500 μL渦旋10 min復(fù)溶，過針式微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液供液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取200 μL空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得空白血漿的色譜圖；另取200 μL空白血漿，加入“2.4.2”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)血樣后按 “2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得含對(duì)照品血漿的色譜圖；另取大鼠給藥1 h后的含藥血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得含藥血漿的色譜圖。結(jié)果顯示，內(nèi)標(biāo)、烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的保留時(shí)間分別為2.53、3.64、3.11、3.78、2.69、2.53、2.79 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾6種生物堿成分和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，專屬性良好。色譜見圖2。

2.4.2 線性關(guān)系與定量限考察 精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量，以異丙醇-三氯甲烷[6]（等體積比）制備質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、40、60、100 μg/L的系列混合對(duì)照品溶液（6種生物堿質(zhì)量濃度相同）。取空白血漿200 μL，分別加入上述系列混合對(duì)照品溶液20 μL，使血樣中各生物堿的質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、10 μg/L，其余按“2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。以各生物堿的血藥濃度為橫坐標(biāo)（x）、其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），按最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得上述6種附子生物堿標(biāo)準(zhǔn)回歸方程分別為y=0.133 1x+0.069 1（r=0.997 5）、y=0.089 0x+0.197 1（r=0.992 1）、y=0.104 5x+0.087 9（r=0.994 9）、y=0.164 2x+0.062 0（r=0.993 6）、y=0.081 4x+0.055 8（r=0.995 4）、y=0.078 8x+0.013 0（r=0.994 8）；血藥濃度線性范圍均為0.1～10 μg/L，定量限均為0.1 μg/L。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量，以異丙醇-三氯甲烷（等體積比）制備質(zhì)量濃度為1、2、10、75 μg/L的混合對(duì)照品溶液。取空白血漿200 μL，分別加入上述混合對(duì)照品溶液20 μL，使血樣中各生物堿質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、1.0、7.5 μg/L，作為質(zhì)控血漿樣品，其余按“2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，考察方法準(zhǔn)確度與精密度。以測(cè)得量和加入量的差值與加入量的比值，考察準(zhǔn)確度（n=5）；每個(gè)質(zhì)量濃度血樣采用5樣本分析，考察日內(nèi)精密度（n=5）；連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度（n=3），結(jié)果見表1。

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 取空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作至氮?dú)獯蹈?，然后向殘?jiān)屑尤胂鄳?yīng)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液適量，氮?dú)獯蹈?、?fù)溶后測(cè)得待測(cè)物濃度（記為c1）；按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、1、7.5 μg/L的質(zhì)控血漿樣品，依法測(cè)得待測(cè)物濃度（記為c2）。以c2和c1的比值計(jì)算提取回收率，每一質(zhì)量濃度采用5樣本分析。結(jié)果，6種附子生物堿的提取回收率均大于75%，RSD均小于10%（n=5）。

2.4.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 取空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作至氮?dú)獯蹈?，然后向殘?jiān)蟹謩e加入1、10、100 μg/L的混合對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液適量，氮?dú)獯蹈?、?fù)溶后進(jìn)樣測(cè)定，每一質(zhì)量濃度采用5個(gè)樣本分析。測(cè)得待測(cè)物峰面積（A1）與內(nèi)標(biāo)峰面積（B1），計(jì)算A1和B1分別與相同濃度樣品溶液（以流動(dòng)相制備）直接進(jìn)樣后所得的待測(cè)生物堿峰面積（A2）和內(nèi)標(biāo)峰面積（B2）的百分比，考察基質(zhì)效應(yīng)。另取6只大鼠空白血漿，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備濃度為0.2 μg/L的質(zhì)控血漿樣品，采用5樣本分析，計(jì)算待測(cè)成分血藥濃度的RSD值，考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品的待測(cè)生物堿和內(nèi)標(biāo)物的峰面積百分比值均在80%～85%（n=5），不同來源生物樣品基質(zhì)效應(yīng)的RSD均小于15%（n=5），表明樣品基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定無明顯干擾。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為0.1、7.5 μg/L的質(zhì)控血漿樣品，在室溫下放置6 h、在-20～20 ℃反復(fù)凍融3次、在-20 ℃放置7 d后，依法測(cè)定；按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為0.1、7.5 μg/L的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃放置5 d，同法制備質(zhì)量濃度為0.1、7.5 μg/L的質(zhì)控血漿樣品，依法測(cè)定；將血漿樣品處理完畢后，在4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h，分別考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，血漿和對(duì)照品溶液中6種附子生物堿在不同存放條件下的濃度RSD均小于11%（n=5），表明兩者穩(wěn)定性均較好。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取健康的雄性Wistar大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，單劑量灌胃附子總生物堿提取物（采用水混懸后，劑量為4 mg/kg）[7]。大鼠給藥2 h后自由飲水，4 h后進(jìn)食。分別于給藥前（0 h）和給藥后0.5、0.75、1.25、1.5、2、4、6、8、10、24 h時(shí)從大鼠眼底靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素化的0.5 mL尖底離心管中，12 000 r/min離心10 min，得上層血漿。取血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并依法測(cè)定血藥濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，用PK-Solver V2.0軟件[8]處理計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖3、表2。

3 討論

附子的臨床療效確切、作用可靠，被多種方劑所采用，但其毒性較大，臨床應(yīng)用易引起中毒[9]。目前，附子中毒主要通過心電圖和中毒癥狀來進(jìn)行臨床診斷，而隨著分析技術(shù)的快速發(fā)展，可通過指標(biāo)性成分的定量分析實(shí)現(xiàn)對(duì)附子中毒的精確判斷[10]。本文建立了HPLC-串聯(lián)四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)血漿中6種附子生物堿的濃度，具有分析速度快、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。

目前，關(guān)于LC-MS法同時(shí)測(cè)定生物樣品中6種附子生物堿的方法已有報(bào)道。肖日平等[11]采用固相萃取法處理血漿樣品，應(yīng)用LC-MS/MS法對(duì)比格犬血中附子生物堿進(jìn)行定量分析，樣品運(yùn)行時(shí)間為6 min，但該方法前處理采用的固相萃取法成本較高。朱定姬等[12]采用在線固相萃取結(jié)合LC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)生物樣品中的附子生物堿，樣品運(yùn)行時(shí)間為10 min，但該方法需要配備自動(dòng)固相萃取裝置，成本較高，操作復(fù)雜。策力木格等[13]采用氨水-乙醚萃取血漿、異丙醇-三氯甲烷復(fù)溶后進(jìn)樣分析，樣品分析時(shí)間為40 min，耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于大批量生物樣品分析。本研究采用甲醇沉淀蛋白、乙腈-1%甲酸水溶液（流動(dòng)相）復(fù)溶后進(jìn)樣分析，樣品運(yùn)行時(shí)間為4 min，方法前處理簡(jiǎn)便易行、樣品運(yùn)行時(shí)間短、成本較低，有利于大批量生物樣品的分析。

本研究以乙腈-1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，考察了水相的酸度（分別含有0.1%、0.5%、1%甲酸），發(fā)現(xiàn)1%甲酸水溶液作為水相時(shí)待測(cè)物峰形最好。其次，以甲醇作為蛋白沉淀劑，考察了甲醇沉淀蛋白直接進(jìn)樣和以流動(dòng)相復(fù)溶后進(jìn)樣分析的差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀蛋白直接進(jìn)樣分析的峰形較差，出現(xiàn)了峰分裂的現(xiàn)象，而以甲醇吹干、流動(dòng)相復(fù)溶后進(jìn)樣分析，待測(cè)物峰形較優(yōu)。此外，本研究參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）方法[6]，以異丙醇-三氯甲烷作為溶劑制備對(duì)照品溶液，樣品吹干后，再以流動(dòng)相復(fù)溶，可以避免因?yàn)槿軇┳兓瘜?dǎo)致的峰形變差。

本研究測(cè)定了附子中6種主要的生物堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程，考慮到不同的成分吸收分布的房室模型不同，筆者采用了統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)處理不依賴于房室模型的劃分，可部分簡(jiǎn)化處理過程。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果，6種附子生物堿的達(dá)峰時(shí)間均在1.2 h左右，說明各生物堿在體內(nèi)吸收迅速，且吸收的速度基本一致；t1/2均在10 h左右，說明其在體內(nèi)代謝和排泄的速率基本一致。6種附子生物堿的峰濃度差距較大，其中毒性較小的單酯型烏頭原堿的血藥濃度均高于毒性較大的雙酯型烏頭堿，而烏頭堿作為雙酯型烏頭堿中毒性最大者，其在6種附子生物堿中血藥濃度最低，由此提示附子總生物堿毒性較小、安全性較好。

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（收稿日期：2017-10-10 修回日期：2018-01-26）

（編輯：段思怡）