木犀草素·4 4′—′—聯(lián)吡啶藥物共晶對小鼠巨噬細胞RAW264.7的抗炎作用研究

劉立新 鄒冬玉 張羽男 張強 張楠楠

中圖分類號 R361+.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0602-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.07

摘 要 目的：研究木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶的抗炎作用及機制。方法：以正常小鼠巨噬細胞RAW264.7為對照，以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細胞為炎癥模型，采用MTT法檢測不同濃度（10、20、40、80 μmol/L）的木犀草素、4，4′ -聯(lián)吡啶和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶作用細胞2 h后的細胞活性；熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法測定40 μmol/L濃度時細胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶2（COX-2）mRNA的表達，酶聯(lián)免疫吸附法測定40 μmol/L濃度時細胞中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）蛋白表達，Western blot法測定40 μmol/L濃度時細胞中核轉(zhuǎn)錄因子p65 （NF-κB p65）蛋白表達。結(jié)果：與正常細胞比較，LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細胞活性明顯降低（P<0.01），iNOS和COX-2 mRNA表達水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表達水平均明顯升高（P<0.01）。木犀草素和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶均能增強LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細胞活性（P<0.05或P<0.01），且呈濃度依賴性；4，4′ -聯(lián)吡啶對LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細胞活性無明顯影響；40 μmol/L濃度下，木犀草素和木犀草素· 4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶可使LPS誘導(dǎo)后細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P<0.05或P<0.01），其中木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶降低效果強于木犀草素（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶可能通過下調(diào)NF-κB信號來抑制炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生，其抗炎作用優(yōu)于木犀草素。

關(guān)鍵詞 木犀草素；4，4′ -聯(lián)吡啶；藥物共晶；小鼠巨噬細胞RAW264.7；抗炎作用

ABSTRACT OBJECTIVE： To study anti-inflammatory effect and mechanism of the luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal. METHODS： Using macrophage RAW264.7 of normal mice as control， the inflammation model was established with lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 cells. MTT assay was used to detect cells activity 2 h after treatment of different concentrations of luteolin （10， 20， 40， 80 μmol/L）， 4， 4′ -dipyridy （10， 20， 40， 80 μmol/L） and luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal （10， 20， 40， 80 μmol/L）. The mRNA expression of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells at 40 μmol/L were determined by qRT-PCR. The protein expression of TNF-α and IL-6 in RAW264.7 cells at 40 μmol/L were determined by ELISA. The protein expression of NF-κB p65 in RAW264.7 cells at 40 μmol/L were determined by Western bolt. RESULTS： Compared with normal cells， the activity of RAW264.7 cells was decreased significantly after induced by LPS （P<0.01）； mRNA expression of iNOS and COX-2， protein expression of TNF-α， IL-6 and NF-κB p65 were increased significantly （P<0.01）. Both luteolin and luteolin· 4， 4′ -dipyridy co-crystal could enhance the activity of RAW264.7 cells after induced by LPS （P<0.05 or P<0.01） in concentration-dependent manner. 4， 4′ -dipyridy had no significant effect on the activity of RAW264.7 cells after induced by LPS. After luteolin and luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal at 40 μmol/L， mRNA expression of iNOS and COX-2， protein expression of TNF-α， IL-6 and NF-κB p65 in RAW264.7 cells after induced by LPS were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal was better than luteolin （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal can inhibit the generation of inflammatory factors by down-regulating NF-κB signal， and its anti-i nflammatory effect is better than luteolin.

KEYWORDS Luteolin； 4， 4′ -dipyridy； Pharmaceutical co-crystal； Mice macrophage RAW264.7； Anti-inflammatory effect

木犀草素為多羥基黃酮化合物，多存在于蔬菜和中草藥中，具有較強的抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、降血壓和抗腫瘤等作用，是一種廣泛存在且具有藥用價值的化合物[1]。然而，由于木犀草素本身存在著水溶性差、生物利用度低等缺點，使其在臨床應(yīng)用中受到限制。為提高木犀草素的溶解度及藥理活性，本研究應(yīng)用藥物共晶合成技術(shù)設(shè)計合成出了木犀草素藥物共晶。藥物共晶合成技術(shù)是一種新興技術(shù)，可以通過引入共晶配體改善原有藥物活性成分的溶解度、溶出速率、生物利用度及穩(wěn)定性等性質(zhì)，而其藥物活性分子本身的結(jié)構(gòu)并不受影響[2]。

木犀草素的抗炎作用與其抑制一氧化氮（NO）和其他炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）的產(chǎn)生有關(guān)[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素與4，4′ -聯(lián)吡啶形成木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶后，兩者形成的分子間作用力（如氫鍵等）致使木犀草素分子原有的堆積方式發(fā)生了顯著變化，但這種變化與其抗炎作用機制和作用效果之間的關(guān)系尚未明確。本研究以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞RAW264.7為炎癥模型，在木犀草素、4，4′ -聯(lián)吡啶和木犀草素· 4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶分別作用下，通過檢測炎癥遞質(zhì)合成分泌的變化，探討木犀草素藥物共晶的抗炎作用效果及機制。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-IFD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Sunrise酶標儀（瑞士Tecan公司）；Forma3111 Series 2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司）；Bio-Rad半干轉(zhuǎn)移電泳儀（美國Bio-Rad公司）；CKX41熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；7300熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）分析儀（美國Applied Biosystems公司）；Tanon 1600R全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Z300-K冷凍離心機（德國Hermle公司）。

1.2 藥品與試劑

木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶（佳木斯大學(xué)天然藥物化學(xué)實驗室自制，批號：20161221，純度：100%）；木犀草素（純度：≥98%）、4，4′ -聯(lián)吡啶（分析純）均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；LPS（美國Sigma公司，批號：118k4052，規(guī)格：100 mg/瓶，來源：大腸埃希菌）；DMEM（高糖）細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；鼠源核轉(zhuǎn)錄因子p65（NF-κB p65）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠源TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（北京科研美科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 細胞

RAW264.7細胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞用含10%胎牛血清和100 u/mL雙抗（青霉素、鏈霉素）的DMEM（高糖）細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞密度為104個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別加入木犀草素、4，4′ -聯(lián)吡啶和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶DMSO溶液（DMSO含量不超過0.2%），終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L，同時設(shè)立正常對照組和LPS對照組，作用2 h后加入1.0 μg/mL的LPS，孵育24 h，之后每孔加入MTT 10 μL（5 mg/mL）孵育4 h，去除培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，振搖10 min，使用酶標儀在570 nm波長處測定光密度（OD），計算細胞存活率（%）=（加藥組OD-空白組OD）/（正常對照組OD-空白組OD）×100%，式中空白組為不加藥物不加細胞的空白對照。

2.3 qRT-PCR法檢測細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達

將RAW264.7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞密度約為106個/mL，用DMEM（高糖）細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，分別加入終濃度均為40 μmol/L的木犀草素、 4，4′ -聯(lián)吡啶和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶溶液，同時設(shè)立正常對照組和LPS對照組，預(yù)處理2 h后加入1.0 μg/mL的LPS，孵育6 h，收集細胞，提取總RNA。具體方法：棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）液清洗細胞，每孔加入1 mL Trizol充分裂解細胞，取細胞至離心管中，室溫靜置3 min，加入200 μL氯仿，渦旋振蕩10 s，室溫靜置2 min，4 ℃下12 000 r/min（離心半徑3 cm）離心10 min，吸取上層水相至另一個離心管，加入500 μL異丙醇，室溫靜置5 min，4 ℃下12 000 r/min（離心半徑3 cm）離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，離心后棄上清，得總RNA沉淀物，取少量用于RNA濃度和純度的測定。提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用qRT-PCR法檢測細胞中一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧合酶2（COX-2）mRNA表達情況。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃，5 s；60 ℃，31 s；共計循環(huán)40次。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct法計算相對表達量，ct為目標擴增產(chǎn)物達到設(shè)定閾值所需要的循環(huán)數(shù)。qRT-PCR檢測的基因引物序列見表1。

2.4 ELISA法檢測細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達

細胞培養(yǎng)、分組及預(yù)處理同“2.3”，預(yù)處理細胞2 h后，加入1.0 μg/mL的LPS共同孵育24 h，收集細胞上清液。分別按鼠源TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒要求操作，檢測細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達水平。

2.5 Western blot法檢測細胞中NF-κB p65蛋白表達

細胞培養(yǎng)、分組及預(yù)處理同“2.3”，預(yù)處理細胞2 h后，加入1.0 μg/mL的LPS共同孵育1 h，收集細胞，提取蛋白并進行蛋白含量測定[5]，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，5%脫脂乳封閉1.5 h后，洗膜3次，置于鼠源NF-κB p65抗體工作液（稀釋比例1 ∶ 1 000）中孵育過夜，洗膜3次，置于HRP標記二抗工作液（稀釋比例1 ∶ 2 000）中室溫振蕩孵育1.5 h，洗膜3次，超敏發(fā)光液顯光，暗室內(nèi)曝光顯影、定影。用凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析蛋白條帶，以目標蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值計算相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量指標以x±s表示，多組間比較采用單因素分析，組間兩兩比較采用t檢驗，百分率或構(gòu)成比比較采用卡方檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 細胞存活率

與正常對照組比較，LPS對照組細胞存活率明顯下降（P<0.01）。與LPS對照組比較，木犀草素和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶能明顯增強細胞存活率（P<0.05或P<0.01），且呈濃度依賴性，當木犀草素和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶濃度大于40 μmol/L時，細胞存活率趨于平穩(wěn)；而4，4′ -聯(lián)吡啶對細胞存活率幾乎無影響。與木犀草素比較，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶增強RAW264.7細胞存活率的效果更顯著（P<0.05）。結(jié)果表明，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶能夠?qū)筁PS對RAW264.7細胞增殖的抑制作用，并且效果優(yōu)于木犀草素。各組細胞存活率變化見圖1。

3.2 細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達水平

與正常對照組比較，LPS對照組細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達水平明顯升高（P<0.01）。與LPS對照組比較，木犀草素組和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達水平明顯降低（P<0.05或P<0.01），4，4′ -聯(lián)吡啶組細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達水平無明顯變化（P>0.05）。與木犀草素組比較，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)果表明，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶能夠有效抑制RAW264.7細胞iNOS和COX-2 mRNA表達，并且效果強于木犀草素。各組細胞中iNOS和COX-2 mRNA表達的變化見圖2。

3.3 細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達

與正常對照組比較，LPS對照組細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。與LPS對照組比較，木犀草素組和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中TNF-α蛋白表達水平明顯降低（P<0.05或P<0.01），木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中IL-6蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），而木犀草素組細胞中IL-6蛋白表達無明顯變化（P>0.05），4，4′ -聯(lián)吡啶組細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達均無明顯變化（P>0.05）。與木犀草素組比較，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)果表明，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶能夠有效抑制RAW264.7細胞中TNF-α和IL-6的分泌，并且效果強于木犀草素。各組細胞中TNF-α、IL-6蛋白表達的變化見圖3。

3.4 細胞中NF-κB p65蛋白表達

與正常對照組比較，LPS對照組細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。與LPS對照組比較，木犀草素組和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P<0.01或P<0.05），4，4′ -聯(lián)吡啶組細胞中NF-κB p65蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）。與木犀草素組比較，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶組細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P<0.01）。結(jié)果表明，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶能夠抑制RAW264.7細胞NF-κB p65蛋白表達，且效果強于木犀草素。各組細胞中NF-κB p65蛋白表達的電泳圖見圖4，變化情況見圖5。

4 討論

炎癥是一個十分常見并且重要的病理過程，可以發(fā)生在機體的各組織和器官，臨床上常用非甾體類抗炎藥物和腎上腺皮脂激素類藥物進行治療，但是兩者均被報道有諸多的不良反應(yīng)[6]。因此，具有資源豐富、毒副作用少等優(yōu)點的中藥逐漸成為人們研究的熱點。據(jù)報道，大部分單味中藥、復(fù)方制劑、中草藥的有效部位和有效成分等均有良好的抗炎作用[7]。木犀草素屬于黃酮類化合物，主要存在于金銀花、菊花等中草藥，以及洋白菜、甜菜和胡蘿卜等蔬菜中[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能下調(diào)LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細胞中COX-2 mRNA的表達，降低NF-κB的活性[9]，可以有效地抑制肺組織的炎癥反應(yīng)，減少肺組織內(nèi)iNOS的表達[4]，木犀草素也可以逆轉(zhuǎn)LPS對細胞增殖的抑制作用，抑制細胞致炎因子TNF-α和IL-6等的表達[10-11]。但是，由于木犀草素純品為粉末狀，微溶于水、穩(wěn)定性差等性質(zhì)，使之很難在臨床上直接應(yīng)用。當前，對木犀草素本身分子進行結(jié)構(gòu)修飾可以有效地改善其水溶性、生物利用度及穩(wěn)定性等，但其原有分子結(jié)構(gòu)的改變將使其變?yōu)樾碌幕衔铮渌幮Ъ岸靖弊饔靡矊l(fā)生難以預(yù)料的改變。 因此，本課題組研究人員引入了藥物共晶合成技術(shù)，在共晶體系中，藥物活性成分主要依靠分子間的氫鍵、范德華力等相互作用與共晶配體形成非共價鍵的超分子晶體結(jié)構(gòu)。

藥物活性成分形成共晶后，其分子結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化，可以保持其原有成分的藥效活性，而其溶解度、溶出速率、生物利用度及穩(wěn)定性等卻會有較大的改變[12]。近年來，研究者們設(shè)計合成出了大量的天然成分藥物共晶。這些藥物共晶水溶性、溶出速率及生物利用度等理化性質(zhì)較原天然活性成分均有顯著提高和改善，并且其抗炎、抗菌及抗溶血等藥理活性也顯著增強。以4，4′ -聯(lián)吡啶為共晶配體的山柰酚藥物共晶和槲皮素藥物共晶對大腸埃希菌（E. coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）的抑菌作用均優(yōu)于山柰酚和槲皮素原料藥[13-14]；分別以胞嘧啶（CYT）和維生素B1為共晶配體的白楊素藥物共晶對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、抗溶血作用以及體內(nèi)大鼠足腫脹抗炎效果均高于原料藥白楊素[15]。

本研究通過檢測木犀草素、4，4′ -聯(lián)吡啶和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶分別對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞活性、炎性相關(guān)因子表達及NF-κB信號的影響，比較和探討了木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶的抗炎作用和作用機制。MTT法試驗結(jié)果表明，隨著木犀草素和木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶濃度的增加，細胞存活率逐漸升高，當濃度大于40 μmol/L時，趨于平穩(wěn)，而 4，4′ -聯(lián)吡啶對細胞活性幾乎無影響，為了便于試驗分析比較，后期試驗均采用統(tǒng)一的濃度為40 μmol/L。本研究結(jié)果表明，木犀草素·4，4′ -聯(lián)吡啶藥物共晶可以通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位而下調(diào)iNOS、COX-2 mRNA表達和TNF-α、IL-6的分泌，提高細胞的增殖活性，并且抗炎效果明顯高于木犀草素原料藥。

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（收稿日期：2017-09-05 修回日期：2017-10-26）

（編輯：鄒麗娟）