駱杰偉　吳永希　黃昉萌　陳煒瑋　朱耀彬　魏世超　鄭星宇　楊笑

摘要：目的 通過高通量16S rDNA測序，探討不同中醫(yī)證型原發(fā)性失眠患者腸道菌群差異。方法 選擇原發(fā)性失眠患者65例，按中醫(yī)證型分為肝郁化火組22例、心脾兩虛組17例、陰虛火旺組26例，健康體檢者47例為對照組。采用高通量16S rDNA測序方法分析患者便菌群結構，QIIME軟件與R語言stats包等分析菌群差異。結果 共得到1226個不同的基因序列分類單元（OTUs），4組間差異有統(tǒng)計學意義的OTUs共180個（P<0.05），表明樣品有豐富的菌落。肝郁化火組、陰虛火旺組測序序列的定位個數多于心脾兩虛組及對照組（P<0.05）。非加權UniFrac分析顯示，組間差異顯著大于組內差異，表明分組有意義（R=0.103，P=0.002），提示腸道菌群多樣性與失眠不同證型高度相關。屬水平在不同組間明顯差異共57個屬（P<0.05），所有物種水平不同組間明顯差異共115個物種（P<0.05）。對照組優(yōu)勢菌屬包括：普雷沃氏菌屬（prevotella）、巨單胞菌屬（megamonas）、梭菌屬（clostridium Ⅺ、clostridiuum ⅩⅧ）、魏斯氏菌屬（weissella）、擬普雷沃氏菌屬（alloprevotella）；肝郁化火組優(yōu)勢菌屬包括：考拉桿菌屬（phascolarctobacterium）、黃桿菌屬（flavonifractor）、埃格特菌屬（eggerthella）、嗜膽菌屬（bilophila）；心脾兩虛組優(yōu)勢菌屬包括：鞘氨醇單胞菌屬（sphingomonas）、甲基桿菌屬（methylobacterium）；陰虛火旺組優(yōu)勢菌屬包括：擬桿菌屬（bacteroides）、副擬桿菌屬（parabacteroides）、parasutterella、butyricimonas、odoribacter。結論 原發(fā)性失眠患者具有豐富的腸道菌群多樣性及不同菌群結構，可能影響著不同中醫(yī)證候的發(fā)生、發(fā)展及結局。

關鍵詞：原發(fā)性失眠；中醫(yī)證候；16S rDNA測序；腸道菌群

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.007

中圖分類號：R256.23 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0028-07

Abstract： Objective To explore structural differences of intestinal flora in primary insomnia patients with different TCM syndromes through the high-throughput 16S rDNA sequencing analysis. Methods Totally 65 patients with primary insomnia were divided into 22 patients with syndrome of liver depression transforming into fire， 17 patients with deficiency of both heart and spleen syndrome， 26 patients with syndrome of hyperactivity of fire due to yin deficiency， with 47 cases of healthy people as the control group. The fecal flora structure of the subjects was analyzed by high-throughput 16S rDNA sequencing. QIIME software and R language stats package were used to analyze the diversity of flora. Results Totally 1226 different operational taxonomic units （OUTs） were obtained， and there were 180 significant differences among the 4 groups （P<0.05）， indicating that the samples were rich in microbial colonies. The mapped reads in group of liver depression transforming into fire and hyperactivity of fire due to yin deficiency were more than the group of deficiency of both heart and spleen and the control group （P<0.05）. Unweighted UniFrac analysis showed that the difference among groups was remarkably greater than the difference within group， and the grouping was statistically significant （R=0.103， P=0.002）. It suggested that the diversity of intestinal flora was highly correlated with different TCM syndromes of insomnia. There were a total of 57 genera found significant differences among the different groups at the genus level （P<0.05）， and 115 species at all species level. The dominant flora of the control group were prevotella， megamonas， clostridium Ⅺ （clostridium ⅩⅧ）， weissella， and alloprevotella； The dominant flora of liver depression transforming into fire syndrome were phascolarctobacterium， flavonifractor， eggerthella， and bilophila； The dominant flora of deficiency of both heart and spleen syndrome were sphingomonas and methylobacterium； The dominant flora in hyperactivity of fire due to yin deficiency syndrome group were bacteroides， parabacteroides， parasutterella， butyricimonas， odoribacter. Conclusion The patients with primary insomnia have abundant intestinal flora diversity and diverse flora structure， which may affect the occurrence， development and outcome of different TCM syndromes.

Keywords： primary insomnia； TCM syndromes； 16S rDNA sequencing； intestinal flora

人體微生物組是指在人體內或表面存在的生態(tài)群落中共生、共棲和致病的微生物的總稱，由Lederberg J等[1]最先提出。廣義人類基因的范疇包括人類基因組和微生物組組合，人的新陳代謝功能具有人與微生物的特性。人體的共生微生物群被認為是“人體第二基因組”。在許多案例中微生物被推定為變異原因，可以影響宿主表型[2]。只有人體基因組與微生物組和諧統(tǒng)一，才能實現人體陰平陽秘。失眠是人群中最常見的精神障礙之一，本研究通過腸道菌群細菌16S rDNA的V3、V4區(qū)域的高通量測序[3-4]，探討不同證型失眠的菌群多樣性特征，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年12月-2017年1月福建省立醫(yī)院原發(fā)性失眠患者65例。平均年齡（49.04±11.70）歲；中位病程6（2.5～15）年；男性31例，女性34例；肝郁化火證22例（男女各11例）、心脾兩虛證17例（男8例，女9例）、陰虛火旺證26例（男12例，女14例）。收集同期福建省立醫(yī)院體檢中心健康體檢者47例為對照組，平均年齡（48.62±12.98）歲；男性24例，女性23例。失眠患者與對照組的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經福建省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（K2015-012-01）。

1.2 西醫(yī)診斷標準

參照《中國失眠防治指南》[5]制定原發(fā)性失眠癥相關標準。在睡眠機會和環(huán)境均良好、充分的條件下，發(fā)生以失眠癥狀為主的睡眠質量不滿意狀況，包括難以入眠、睡眠不深、多夢、醒后不易再睡，早醒，或自覺睡眠明顯不足等。

1.3 中醫(yī)辨證標準

參照《中醫(yī)內科學》[6]制定中醫(yī)辨證標準。由固定的3位中醫(yī)副主任醫(yī)師辨證一致，予以確認。①肝郁化火證：急躁易怒，不寐多夢，甚至徹夜不眠，伴有頭暈頭脹，目赤耳鳴，口干而苦，不思飲食，便秘溲赤。舌紅苔黃，脈弦而數。②心脾兩虛證：多夢易醒，心悸健忘，神疲食少，頭暈目眩，伴有四肢倦怠，面色少華。舌淡苔薄，脈細無力。③陰虛火旺證：心悸不安，心煩不寐，腰酸足軟，伴頭暈，耳鳴，健忘，遺精，口干津少，五心煩熱。舌紅少苔，脈細而數。

1.4 納入標準

①符合上述西醫(yī)診斷及中醫(yī)辨證標準者；②受試者對本研究知情，并簽屬知情同意書。

1.5 排除標準

①軀體疾病或大腦精神、意識功能障礙等所致的繼發(fā)性失眠；②患有糖尿病、血液病、心力衰竭、腎衰、感染性疾病等基礎疾病；③患有肝炎、結核病等傳染性疾病；④有吸煙和飲酒嗜好者；⑤不能進行正常交流及合作者；⑥有放化療史者。

1.6 方法

1.6.1 糞便樣品采集、DNA提取

檢查前1 d禁酒及藥物，檢查前8 h禁食。晨起7時取糞便樣本，樣本取備按照流程HMP手冊（Version 12.0，Accession：phd003190.2）。分裝后立即置于-80 ℃冰箱。DNA提取嚴格按MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit說明書進行。采用16s rRNA通用引物27F/1492R（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）對提取的DNA樣品進行PCR擴增，用Thermo Nano Drop 2000及瓊脂糖凝膠電泳質控PCR產物，27F、1492R引物由Lifetech/Thermo合成。

1.6.2 16s rDNA基因V3、V4區(qū)測序

PCR擴增和產物純化后，經文庫質檢合格，使用Qubit進行文庫定量，根據每個樣品數據量要求，進行相應比例的混合均一化。用16S特定引物擴增特異可變區(qū)V3、V4區(qū)域，得425 bp擴增片段。加接頭（adeptor linkage），采用MiSeq PE300測序，應用PANDAseq軟件拼接配對雙端的reads[7]。經過拼接處理后，得到較長堿基序列（clean reads），進行16S分析。細菌16S rDNA的測序引物，U341：CCTACGG GRSGCAGCAG，U806：GGACTACVVGGGTATCT AATC[3-4]。由上海銳翌生物科技有限公司進行測序。

1.6.3 基因序列分類單元聚類

將序列完全一樣的clean reads歸為1種tag，統(tǒng)計每條tag對應的豐度（即reads數目），根據tags豐度大小進行排序。因為singletons（對應reads只有1條的序列）可能由于測序錯誤造成，故去除該部分序列，不進行后期基因序列分類單元（OTUs）聚類。利用usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾，得到用于物種分類的OUT，將所有clean reads比對到OTUs序列上，比對上OTUs的reads提取出來得到最終的mapped reads[8]。利用Ribosomal Database Project（RDP）數據庫，比對該代表序列與已知物種的16S DNA，對每個OTUs進行物種歸類[9]。

1.6.4 樣品復雜度分析與統(tǒng)計學方法

用QIIME軟件分析Alpha多樣性與Beta多樣性[10]，采用迭代算法，分別在加權物種分類豐度信息和不加權物種分類豐度信息的情況下進行差異計算，做出組間的距離box圖。2組間差異分析采用R語言stats包的wilcox.test函數，多組間差異分析采用R語言kruskal.test函數。

2 結果

2.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映單個樣品的物種多樣性，包括observed species指數、chao1指數、PD whole tree指數等[10]。observed species和chao1指數反映樣品中群落的豐富度（species richness），如樣品中物種多樣性較高，顯示較多未被測序檢測到的物種。Shannon指數、simpson指數反映的是群落的多樣性（species diversity）。PD whole tree指數反映了樣品中物種對進化歷史保存的差異，PD whole tree指數越大說明物種對進化歷史保存的差異越大。4組間諸種指數差異不明顯（P>0.05）。見表1。

2.2 基因序列分類單元分析

OTUs的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。kruskal.test檢驗提示肝郁化火組、陰虛火旺組樣本的mapped reads較心脾兩虛組、對照組多（P<0.05），說明前2組具有更多的物種多樣性，見表2。本研究共得到1226個不同的OTUs，4組差異有統(tǒng)計學意義的OTUs有180個（P<0.05）。

2.3 樣本復雜性與顯著性差異分析

物種profiling柱狀圖可直觀顯示各樣本的物種及其豐度，初步顯示各組物種差異。在屬水平，各樣本豐度高的前20物種profiling柱狀圖，見圖1。選擇豐度前30的差異物種，通過R軟件corrplot包繪制優(yōu)勢物種間spearman相關性熱圖，通過該熱圖發(fā)現優(yōu)勢物種之間重要的模式與關系。種間關系會影響物種豐度，從屬水平反映各菌屬的共生、拮抗關系的強弱，見圖2。相似性分析（Anosim分析）檢驗，即非加權UniFrac，顯示組間差異顯著大于組內差異，分組有意義（非加權R=0.103，P=0.002）。可見，腸道微生物的不同多樣性與失眠不同中醫(yī)證型呈現高度相關。

LDA EffectSize（LEfSe）Tools采用線性判別分析（LDA）估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小，找出對樣品歸類產生顯著性差異影響的群落或物種[11]。本研究4組間有差異物種見表3。通過Kruskal-Wallis test分析，屬水平找出在不同組間有明顯差異共57個屬（P<0.05），其中部分屬種熱圖（heatmap）、箱線圖（boxplot）見圖3、圖4。所有物種水平可以找出在不同組間有明顯差異共115個物種（P<0.05），其中部分屬種熱圖、箱線圖見圖5、圖6。分析可見，對照組優(yōu)勢菌屬有普雷沃氏菌屬（prevotella）、巨單胞菌屬（megamonas）、梭菌屬（clostridiumⅪ、clostridiuumⅩⅧ）、魏斯氏菌屬（weissella）、擬普雷沃氏菌屬（alloprevotella）等菌屬；肝郁化火組優(yōu)勢菌屬有考拉桿菌屬（phascolarctobacterium）、黃桿菌屬（flavonifractor）、埃格特菌屬（eggerthella）、嗜膽菌屬（biophila）等菌屬；心脾兩虛組優(yōu)勢菌屬有鞘氨醇單胞菌屬（sphingomonas）、甲基桿菌屬（methylobacterium）等菌屬；陰虛火旺組優(yōu)勢菌屬有擬桿菌屬（bacteroides）、副擬桿菌屬（parabacteroides）、parasutterella、butyricimonas、odoribacter等。

3 討論

《素問·逆調論篇》言：“胃不和則臥不安。”中醫(yī)學早已認識到胃腸道功能與睡眠障礙密切相關。近年來，隨著測序技術的發(fā)展，腸道菌群與精神神經疾病的相關性得到廣泛關注。如孤獨癥、帕金森病、精神分裂癥、抑郁癥、阿爾茨海默病、神經退行性疾病等常伴有腸道菌群失調，二者互相影響。若患者長期失眠，處于焦慮、抑郁等應激狀態(tài)下，則影響腸道菌群動態(tài)平衡[12]。本研究發(fā)現，考拉桿菌屬、嗜膽菌屬等為失眠肝郁化火證優(yōu)勢菌屬，而考拉桿菌屬為定植在腸道內條件致病菌。有研究表明，其豐度與抑郁癥、腸易激綜合征及陽虛質有關[13]。研究發(fā)現，抑郁癥患者顫桿菌屬、嗜膽菌屬的豐度明顯升高，普雷沃氏菌屬、糞球菌屬（coprococcus）豐度下降[14]；普雷沃氏菌屬在本研究為對照組的優(yōu)勢菌群，可見在失眠肝郁化火證中為劣勢。有報道，腦卒中后抑郁癥患者腸道菌群結構異常，以考拉桿菌屬、顫桿菌屬（oscillibacter）、parasutterella為優(yōu)勢菌屬[15]。本研究顯示，parasutterella、擬桿菌屬、副擬桿菌屬等為失眠陰虛火旺證優(yōu)勢菌屬。褪黑色素是睡眠與覺醒調節(jié)的重要物質之一，用褪黑素復合制劑后，腸道內擬桿菌屬較前明顯下降[16]，可見失眠與菌群結構失調明顯相關。

動物實驗亦表明，疾病、精神行為與腸道菌群也有密切關系。在相對缺乏腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）的小鼠中，迷走神經發(fā)育發(fā)生變化可能影響腸道菌群[17]，口服抗生素后腸道菌群擬桿菌屬含量升高，而副擬桿菌屬、顫螺菌屬（oscillospira）、考拉桿菌屬含量下降，影響大腦BDNF表達?；謴湍c道菌群后，可恢復腦功能[18]。而擬桿菌屬、副擬桿菌屬等為本研究中失眠陰虛火旺證優(yōu)勢菌屬，考拉桿菌屬為失眠肝郁化火證優(yōu)勢菌屬，這些菌群失衡參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。腸道菌群失衡影響精神行為，又如當無菌小鼠（GF）BALB/c、NIHSwiss接種同種小鼠的腸道菌群后，其行為與同種小鼠的行為類似，但接種不同種小鼠的腸道菌群后，其行為則受腸道菌群供體源小鼠的影響，表現出與供體小鼠相類似的行為[19]。從而說明腸道菌群可直接調控大腦功能，影響生物行為。動物實驗亦發(fā)現，孕期母體高脂肪飲食導致子代腸道內乳酸桿菌缺乏，出現社交缺陷及腦獎賞環(huán)路突觸強化功能缺陷，通過后期定植乳酸桿菌可改善[20]。腸道梭形桿菌數量減少會引起小鼠應激能力減弱[21]。也有發(fā)現空腸彎曲桿菌感染小鼠后，迷走神經張力增加，大腦中神經元激活標志物c-Fos表達增加，導致感染小鼠出現焦慮行為[22]。

人體共棲的腸道菌群引起疾病的機制尚不清楚。目前研究認為，微生物可能通過下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）或直接影響腸道上皮的通透性，誘導炎癥反應及胰島素抵抗等[23-24]，腸道微生物也可通過復雜的腸-腦軸機制影響人的情緒、行為等。失衡的菌群可能引起或加重大腦組織中的腦神經元損傷，影響宿主行為和大腦功能。通過人為改變實驗動物原有的腸道菌群結構，其焦慮抑郁狀態(tài)、認知行為及神經系統(tǒng)發(fā)育與正常動物有明顯區(qū)別[25-26]。BDNF廣泛分布于大腦中樞神經系統(tǒng)內，對神經元的生長發(fā)育、分化及存活有較大影響。在GF海馬等區(qū)域的BDNF蛋白、mRNA表達明顯降低，常伴有HPA軸發(fā)育異常，對應激反應、認知發(fā)生改變[25，27-29]。GF的5-羥色胺（5-HT）和谷氨酸受體的表達也出現異常[30]。5-HT影響情緒、自主功能、神經肌肉及內臟功能，腸道菌群及其代謝產物也影響體內5-HT產生。5-HT表達主要與產芽孢細菌密切相關[31]。顫桿菌屬是定植于腸道內的厭氧條件致病菌，與抑郁癥、心腦血管疾病以及腸道菌群代謝產物血漿氧化三甲胺（TMAO）的合成與代謝相關[13，32]。目前大多認為，血漿TMAO升高是心血管危險因素。中樞神經系統(tǒng)的活動與免疫系統(tǒng)密切相關，長期定植于宿主體內的共生菌群免疫系統(tǒng)會自動識別侵入腸道內病原菌，產生免疫反應，是通過腸上皮細胞啟動及傳導的信號如Toll樣受體來實現[33-34]。此外，相關細菌也可以促進免疫功能，如腸道微生物中的分節(jié)絲狀菌、擬桿菌、梭形菌等促進了T細胞分化，產生腸道強大的先天性、適應性免疫應答[35]。腸道內共有多種與腸內分泌相關的細胞，通過HPA軸聯(lián)系中樞，應激時皮質醇釋放，作用于腸道，影響免疫、腸道黏膜滲透性及腸道屏障功能，改變菌群構成。反之，失調的腸道菌群也可通過HPA軸調控大腦功能，支配腸道內外的神經共同形成多條反射回路來調控腸道活動與應激反應。

綜上所述，腸道菌群的改變可能是引起精神性疾病如失眠的危險因子，或失眠導致腸道菌群結構的改變，二者互相影響則表現出不同中醫(yī)證候特征，如大便性狀的改變。

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（收稿日期：2017-09-14）

（修回日期：2017-10-22；編輯：季巍?。?/p>